羊毛醇中胆固醇提取工艺的研究

郭庆，赵露，李凯，徐宾朋，赵厚发

（安徽科宝生物工程有限公司，安徽 淮北 235000）

羊毛脂是由羊皮脂腺分泌的酯类物质的多组分混合物, 主要是由脂肪酸与大致等量的脂肪醇、甾醇、三甲基甾醇等所形成的酯[1]。羊毛脂中含有10%～20%的胆固醇, 胆固醇是构成动物细胞膜的重要组成部分，也是合成胆汁酸、VD3、甾醇类激素等物质的前体，具有广泛的市场需求，同时也是化妆品、液晶等的主要原料[2]。我国羊毛脂资源非常丰富，每年约有2～3 万t，但是利用率只有10%左右，其余被排放，造成巨大资源浪费[3]。

羊毛脂中胆固醇提取的关键是先将羊毛醇与羊毛酸分离，再从羊毛醇中提取胆固醇。从羊毛醇中提取胆固醇方法主要有：分子蒸馏法、柱层析法、微生物发酵法、配合法和溶剂选择结晶法等[4-6]。分子蒸馏法因对设备及操作条件有较高要求, 分出的胆固醇含量较低, 蒸馏残渣多；柱层析法因固有性质阻碍了大规模的应用；微生物发酵法，菌株的筛选很困难，在工业上很难实施；配合法和溶解选择结晶法的关键在于羊毛脂的皂化是否彻底。

本文以粗羊毛脂经预处理[7]得到的羊毛醇为原料, 采用溶剂选择结晶法，通过皂化、萃取、浓缩、结晶及重结晶等工序，优化工艺条件，建立了胆固醇的产业化工艺路线。

1 材料与仪器

1.1 材料

羊毛脂，工业级，济南某公司；无水乙醇，食品级，安徽安特食品股份有限公司；氢氧化钾、环己烷、乙酸乙酯、硫酸，工业级，山东海化股份有限公司；胆固醇对照品，中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器

3 000 L 皂化釜、3 000 L 萃取釜、3 000 L 浓缩罐、2 000 L 结晶罐、2 000 L 重结晶罐、平板离心机-800，江苏炬峰机械有限公司；PHS-3C pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TCS 电子台秤，厦门佰伦斯电子科技有限公司；LC-2030 高效液相色谱仪，岛津公司。

2 实验方法

2.1 皂化条件的优化

称取羊毛醇，加入氢氧化钾溶液和乙醇，考察氢氧化钾用量、乙醇用量及时间对胆固醇的收率和含量的影响。

2.2 萃取剂用量

向降至常温的皂化液中加入环己烷，重复萃取2 次，检测皂化液中是否还含有胆固醇。

2.3 结晶和重结晶

将萃取液浓缩至干，称重，加乙酸乙酯和水，加热回流时间1 h，降温冷却结晶，过滤，干燥得到粗品胆固醇；重结晶，称重，加无水乙醇，调pH，加热回流，降温冷却结晶，干燥得精品胆固醇。

2.4 含量指标测定

称取精品胆固醇，按照《中国药典》[8]中规定的方法测定含量。HPLC 条件与方法：色谱柱规格为4.6 mm×250 mm，设定流速为1.0 mL·min-1，波长为210 nm， 柱温为30 ℃，计算方法为外标法。

3 结果分析

3.1 皂化条件的优化

羊毛醇皂化是否彻底是提取胆固醇的关键，优化皂化工艺条件可提高胆固醇的收率，经初步实验发现，氢氧化钾溶液用量（A）、乙醇用量（B）和皂化时间（C）是3 个比较重要的因素，选取了不同水平对同一批羊毛醇（胆固醇质量分数25.8%）进行正交实验，每个实验取用100 kg 羊毛醇，结果如表1 所示。

表1 正交实验因素与水平表

所得的皂化液经相同的萃取、结晶和重结晶步骤得到精品胆固醇，对其中的含量（质量分数）用HPLC 分析，比较不同条件下的胆固醇的收率，实验结果如表2 所示。

表2 皂化条件的正交实验结果

由表2 可以看出，根据极差的大小，可确定影响因素是C＞A＞B，即时间对胆固醇的收率影响最大，其次为氢氧化钾溶液的用量，最后是乙醇的用量。皂化时间控制在4～9 h[9]，随着皂化时间的延长，胆固醇的收率也在增加，但增加到一定量时，胆固醇的收率趋于稳定，其中的原因可能是羊毛醇与氢氧化钾反应需要的时间刚好，少于反应时间，皂化不彻底，多于时间也不再进行反应。因此，通过各因素对胆固醇收率影响的综合分析，得出的优化条件为：氢氧化钾溶液的用量为羊毛醇质量的1 倍，乙醇用量为羊毛醇质量的2 倍，皂化时间为7 h，即A2B2C3。

3.2 萃取剂用量的优化

分别称羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%碱液100 kg，时间为7 h；降至常温，分别加4 倍量、5 倍量和6 倍量环己烷，搅拌10 min，静置50 min，重复萃取2 次；得浓缩物，加乙酸乙酯结晶，加无水乙醇进行重结晶，得到的胆固醇质量分数达到95%以上，再检测比旋度、醇溶度、残渣等主要指标，所得结果见表3。

表3 不同萃取剂添加量对胆固醇收率的影响

由表3 可以看出，随萃取剂用量增加，胆固醇的收率也在增加，但增加到一定量时，胆固醇的收率增加不明显，其中的原因是，添加5 倍量，重复萃取2 次，皂化液中的胆固醇已基本被全部萃取出来，当继续增加萃取剂量时，皂化液中微量的胆固醇不能被萃取剂萃取出来，从而使胆固醇的收率变化不大。

3.3 结晶和重结晶的优化

3.3.1 结晶工艺的优化

分别称羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%碱液100 kg，时间为7 h；降至常温，加5 倍量环己烷，搅拌10 min，静置50 min，重复萃取2 次；得到的浓缩物分别加6 倍量、8 倍量和10 倍量的乙酸乙酯和1 倍量的水调pH=4～5，加热回流1 h，降温冷却结晶，离心机离心得胆固醇，干燥；用乙醇重结晶，离心干燥得的胆固醇质量分数达到95%以上，结果如表4 所示。

表4 不同乙酸乙酯添加量对胆固醇收率的影响

由表4 可以看出，随着乙酸乙酯的用量增加，胆固醇的收率也在增加，但增加到一定量时，胆固醇的收率反而下降[10]，其中的原因是，添加8 倍量的乙酸乙酯时，浓缩物中的胆固醇全部溶解在试剂中，通过调整水层的pH，其中杂质进入到水中被去除掉；加6 倍量时，溶解完后，过滤时堵过滤器，说明加热的回流的条件下胆固醇可以溶解在乙酸乙酯中，但稍微降温，就出现胆固醇过饱和，结晶析出，影响收率；加10 倍量时，通过调整水层的pH，其中的杂质进入水中被去除掉，因乙酸乙酯过量，过滤后，母液中带有胆固醇，从而影响胆固醇的收率。

3.3.2 重结晶工艺的优化

分别称羊毛醇100 kg、乙醇200 kg、10%碱液100 kg，时间为7 h；降至常温，加5 倍量环己烷，搅拌10 min，静置50 min，重复萃取2 次；得到的浓缩物分别加 8 倍量的乙酸乙酯和1 倍量的水调pH=4～5，加热回流1 h，降温冷却结晶，离心机离心得胆固醇，干燥；分别加6 倍量、8 倍量和10 倍量的乙醇，调pH=10.5～11.0，加热回流1 h 进行重结晶，过滤，降温冷却结晶，离心干燥得到的胆固醇质量分数达到95%以上，所得结果见表5。

表5 不同无水乙醇添加量对胆固醇收率的影响

由表5 可以看出，随着乙醇的用量增加，胆固醇的收率也增加，但增加到一定量时，胆固醇的收率反而下降[11]，其中的原因是，添加8 倍量的乙醇时，胆固醇全部溶解在试剂中；加6 倍量时，溶解完后，过滤时堵过滤器，说明加热回流的条件下胆固醇可以溶解在乙醇中，但稍微降温，就出现胆固醇过饱和，结晶析出，影响收率；加10 倍量时，因乙醇过量，过滤后，母液中带有胆固醇，从而影响胆固醇的收率。

4 结 论

羊毛脂经过预处理后，羊毛醇中含有25.8%胆固醇，采用皂化、萃取、浓缩结晶及重结晶等工艺步骤建立了胆固醇的产业化工艺路线，以胆固醇收率为指标确定的优化工艺如下：乙醇用量为2 倍量，10%碱液用量1 倍量，时间为6 h；加环己烷为皂化液总质量的5 倍，时间为60 min，重复萃取2 次；用乙酸乙酯为结晶试剂，其用量为8 倍量，加热回流时间1 h；用无水乙醇进行重结晶，用量为胆固醇质量的8 倍量，pH=10.5，回流时间2 h，结晶温度为5～10 ℃，所得胆固醇产品的收率≥90%，质量分数≥98%，熔点≥147 ℃。