氚水长期暴露对斑马鱼子代生长发育影响的研究

顾鹏 诚 罗发坚 薛惠元 陈娜 孙亮 万骏 崔凤梅 涂彧

苏州大学苏州医学院放射医学与防护学院，放射医学与辐射防护国家重点实验室，苏州 215123

氚是氢的同位素之一，随着核技术的应用与发展，核试验、核反应堆、核燃料后处理、核事故的发生等会导致大量的氚排放到环境中[1-3]。氚的理化性质决定了其在环境中大多以氚水的形式存在，且可以经皮肤、伤口、呼吸道、消化道等多种途径进入生物体内造成内照射损伤[4]。高剂量氚的相对生物效能（relative biological effectiveness, RBE）值为1[5]，但近年来的一些研究结果表明，低剂量氚（＜100 mGy）的RBE 值可能＞1，且RBE 值在一定范围内随氚水剂量的降低而升高[6-7]。低剂量氚水所致的生物效应不易观察，需要通过构建合适的动物模型才可以检测[8]。

斑马鱼是一种模式生物，其具有体型小、养成周期短、产卵量大、胚胎透明、成本低等优点[9]，是国际标准化组织（ISO）认可的5 种鱼类实验动物之一，被经济合作与发展组织（OECD）推荐用于各种类型的生态毒理学试验[10-11]。

本研究拟通过斑马鱼构建氚水长期暴露动物模型，并在此基础上检测斑马鱼子代发生的改变[12]，初步探讨斑马鱼长期氚水暴露可能导致的子代生物效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用成年AB 品系野生型斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心。本实验经苏州大学动物保护和使用委员会批准，符合《实验动物护理和使用指南》的要求。

1.2 试剂与仪器

氚水购自美国PerkinElmer 公司；培养基（5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.03 mmol/L MgSO4，0.01%亚甲基蓝和1 L 去离子水）为本实验室自行配制；PBS 购自美国AXYFEN 公司；总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；三卡因（Tricaine）购自苏州格瑞特医药技术有限公司；高氯酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；过氧化氢购自上海凌峰化学试剂有限公司。5 ml 可立冻存管购自苏州科技有限公司；斑马鱼养殖系统购自青岛金水海洋生物设备有限公司；低本底液闪计数器（Tri-Carb 2910TR 型）购自美国PerkinElmer 公司；MoticSMZ-168 型体式显微镜购自厦门麦克奥迪实业集团有限公司；十二孔细菌培养板购自上海赛默尔世飞科技（中国）有限公司；MF52-N 型荧光显微镜购自广州明美光电技术有限公司；KZ-Ⅲ型研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司；DK-S22 型电热恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 氚水长期暴露斑马鱼模型的建立

将正常斑马鱼所产胚胎分别暴露于0、1×102、1×105Bq/L 的氚水中3 个月以上作为亲代（记作F0代），待其性成熟后进行繁殖得到子代（记作F1代）并继续饲养在对应浓度的氚水中。按照斑马鱼的发育阶段，分别选取合适的指标对胚胎期、幼苗期、幼鱼期、成鱼期斑马鱼进行相关检测。

1.3.2 F1 代斑马鱼孵化率的检测

采用简单随机方法分别从0、1×102、1×105Bq/L的3 组氚水暴露F0 代斑马鱼成鱼所产胚胎中选取50 枚胚胎，继续暴露在与F0 代对应的0、1×102、1×105Bq/L 氚水中，第7 天时统计每组50 枚胚胎的孵化数并计算孵化率（孵化率=孵化的斑马鱼数量/50×100%），期间及时去除死卵。上述实验至少重复3 次。

1.3.3 F1 代斑马鱼自主运动、心率、体长的检测

在F1 代受精后24、36 h，采用简单随机方法分别从1.3.2 中的3 组F1 代斑马鱼胚胎中各选取10 枚胚胎，使用体式显微镜对斑马鱼胚胎1 min内的自主运动次数计数；受精后48、60 h，采用简单随机方法分别从上述3 组胚胎中各选取10 枚胚胎，使用体式显微镜对斑马鱼胚胎20 s 内的心脏跳动次数计数；受精后72、84 h，采用简单随机方法分别从上述3 组斑马鱼胚胎中各选取10 条斑马鱼幼苗，在体式显微镜下拍照，应用麦克奥迪图像软件（Motic Images Plus，厦门麦克奥迪实业集团有限公司）计算3 组斑马鱼幼苗的体长。上述实验均至少重复3 次。

1.3.4 F1 代斑马鱼幼苗ROS 含量的检测

将F0 代3 组斑马鱼所产胚胎继续暴露于与F0代对应的0、1×102、1×105Bq/L 3 组不同浓度的氚水中，在斑马鱼胚胎受精4～5 h 时加入0.003% 苯基硫脲（PTU）溶液以抑制斑马鱼体内黑色素的生成。在斑马鱼幼苗鱼龄达4 d 时，采用简单随机方法从0、1×102、1×105Bq/L 的3 个浓度氚水暴露组中各选取10 条斑马鱼鱼苗进行实验。每组斑马鱼鱼苗分别加入12 孔板中，用PBS 清洗3 次，随后加入1 ml 含10 μmol/L DCFH-DA（2, 7-二氯荧光素二乙酸酯）的PBS，于28.5℃、避光环境中孵育1 h。孵育结束后，用PBS 清洗3 次以去除多余的探针，在荧光显微镜下拍照记录3 组斑马鱼体内的ROS 荧光强度。采用简单随机方法从3 组中分别选取4 条斑马鱼，采用Image J 软件（美国NIH 公司）对其全身的荧光强度进行定量分析。

1.3.5 F1 代斑马鱼幼鱼T-SOD、MDA 含量的检测

采 用 简 单 随 机 方 法 选取F1 代0、1×102、1×105Bq/L 3 个浓度氚水暴露组斑马鱼幼鱼中鱼龄达45、60 d 的各3 条，准确称量体重后按照体重（g）∶生理盐水（ml）=1∶9 的比例在研磨仪上研磨制成10%的组织匀浆，再使用生理盐水稀释为5%的组织匀浆。吸取5%的组织匀浆30 μl，使用生理盐水稀释为1%的组织匀浆检测T-SOD 的含量；吸取5%的组织匀浆100 μl，使用二喹啉甲酸（BCA）法对蛋白浓度进行定量分析；吸取5%的组织匀浆100 μl 检测MDA 的含量。实验步骤均严格按照对应试剂盒的说明书进行。

1.3.6 F1 代斑马鱼成鱼产卵量的统计

采用简单随机方法分别选取0、1×102、1×105Bq/L 3 个浓度氚水暴露组中4 月龄以上性成熟的F1 代斑马鱼雌、雄鱼各1 条，在交配前1 天晚上放入配鱼缸，中间用隔板隔开。第二天上午9 点，自动光照系统（本实验室自制）开启后将隔板拿开，雌鱼开始产卵2 h 后收集斑马鱼胚胎并计数。上述实验至少重复3 次。

1.3.7 F1 代斑马鱼体内氚含量的检测

采用简单随机方法分别选取0、1×102、1×105Bq/L 3 个浓度氚水暴露组中鱼龄为45、60 d的斑马鱼幼鱼各3 条，使用三卡因将其麻醉后用纯净水冲洗3 次，擦干幼鱼体表水分后称量体重，按照体重（g）∶生理盐水（ml）=1∶9 的比例在研磨仪上研磨制成10%的组织匀浆。吸取10%的组织匀浆500 μl 于5 ml 可立冻存管中，加入500 μl 消解液（HClO4∶H2O2=2∶3），在70℃电热恒温水浴锅中消解至少1 h，待消解完全后吸取全部液体于20 ml液闪瓶中，加入7 ml 纯净水混合均匀。对照组为8 ml 纯净水。在避光条件下，向液闪瓶中加入12 ml 闪烁液并充分振荡，加盖密封暗化12 h 以上至液体澄清后，使用低本底液闪计数器对斑马鱼体内的总氚含量进行检测。检测过程全程避光，检测时间10 min，检测设置内循环1 次，外循环3 次。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 9 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间的比较采用t检验（方差齐）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 F1 代斑马鱼孵化率的比较

由图1 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组斑马鱼的孵化率分别为（90.66±0.05）%、（85.63±0.10）%、（78.06±0.15）%。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼孵化率的差异均无统计学意义（t=0.785、1.370，P=0.462、0.220）。

图1 不同浓度氚水长期暴露F1 代斑马鱼孵化率的比较Figure 1 Comparison of hatching rate of F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.2 F1 代斑马鱼自主运动、心率、体长的比较

由图2 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组斑马鱼受精后24 h 的自主运动次数分别为（12.93±2.70）、（11.30±0.78）、（10.50±0.80） 次/min。与0 Bq/L氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后24 h 自主运动次数的差异均无统计学意义（t=1.008、1.499，P=0.370、0.208）。3 组斑马鱼受精后36 h 的自主运动次数分别为（3.63±1.43）、（4.50±1.15）、（5.40±3.55） 次/min。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后36 h 自主运动次数的差异均无统计学意义（t=0.817、0.799，P=0.460、0.469）。

图2 不同浓度氚水长期暴露F1 代斑马鱼受精后不同时间自主运动次数、心率、体长的比较Figure 2 Comparison of autonomous movement, heart rate and body length of F1 generation zebrafish at different times after fertilization after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 组斑马鱼受精后48 h 的心率分别为（59.43±6.93）、（65.00±3.30）、（61.23±4.55） 次/20 s。与0 Bq/L氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后48 h 心率的差异均无统计学意义（t=1.256、0.376，P=0.278、P=0.726）。3 组斑马鱼受精后60 h 的心率分别为（69.87±2.71）、（66.17±6.97）、（69.77±9.08） 次/20 s。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后60 h 心率的差异均无统计学意义（t=0.857、0.018，P=0.440、0.986）。

3 组斑马鱼受精后72 h 的体长分别为（3.20±0.22）、（3.32±0.08）、（3.29±0.06） mm。与0 Bq/L氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后72 h 体长的差异均无统计学意义（t=0.614、0.178，P=0.525、0.868）。3 组斑马鱼受精后84 h 的体长分别为（3.42±0.07）、（3.46±0.11）、（3.40±0.04） mm。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼受精后84 h 体长的差异均无统计学意义（t=0.527、0.496，P=0.626、0.646）。

2.3 F1 代斑马鱼幼苗体内ROS 荧光强度的比较

由图3 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组斑马鱼的ROS 荧光强度分别为（21.07±4.74）、（23.71±7.73）、（23.19±5.32）。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼幼苗ROS 荧光强度的差异均无统计学意义（t=0.582、0.593，P=0.582、0.575）。

图3 不同浓度氚水长期暴露F1 代斑马鱼幼苗活性氧荧光强度的比较Figure 3 Comparison of reactive oxygen species fluorescence intensity of F1 generation zebrafish seedlings after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.4 F1 代斑马鱼幼鱼体内T-SOD、MDA 含量的比较

由图4 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组斑马鱼45 d 的T-SOD 含量分别为（41.84±4.91）、（42.30±5.04）、（36.97±5.26） U/mgprot。与0 Bq/L氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼45 d T-SOD 含量的差异均无统计学意义（t=0.112、1.171，P=0.916、0.307）。3 组斑马鱼60 d 的T-SOD 含量分别为（36.93±1.91）、（34.07±3.02）、（33.54±1.87） U/mgprot。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼60 d T-SOD 含量的差异均无统计学意义（t=1.397、2.195，P=0.240、0.093）。

图4 不同浓度氚水长期暴露F1 代不同鱼龄斑马鱼幼鱼体内T-SOD、MDA 含量的比较 a 表示与0 Bq/L 氚水暴露组比较，差异有统计学意义（t=2.831，P=0.047）。T-SOD 为总超氧化物歧化酶；MDA 为丙二醛Figure 4 Comparison of total superoxide dismutase and malondialdehyde content in F1 generation zebrafish of different age after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 组斑马鱼45 d 的MDA 含量分别为（3.60±1.56）、（3.59±0.44）、（2.95±0.58） nmol/mgprot。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼45 d MDA 含量的差异均无统计学意义（t=0.007、0.677，P=0.995、0.536）。3 组斑马鱼60 d 的MDA 含量分别为（4.00±0.52）、（4.19±1.37）、（3.01±0.32） nmol/mgprot。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼60 d MDA 含量的差异无统计学意义（t=0.229，P=0.830），1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼MDA含量的差异有统计学意义（t=2.831，P=0.047）。

2.5 F1 代斑马鱼产卵量的比较

由图5 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组斑马鱼产卵量分别为（188±88）、（204±22）、（220±40）枚。与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L氚水暴露组F1 代斑马鱼产卵量的差异均无统计学意义（t=0.400、0.757，P=0.700、0.477）。

图5 不同浓度氚水长期暴露F1 代斑马鱼成鱼产卵量的比较Figure 5 Comparison of eggs laid by adult F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.6 F1 代斑马鱼体内总氚含量的比较

1×105Bq/L 氚水长期暴露条件下，F1 代斑马鱼的鱼龄达60 d 时，测得其体内总氚含量为（32.23±1.97） Bq/g。

3 讨论

在研究低剂量氚水长期暴露所致生物效应时需要选取合适的暴露浓度与实验动物模型。目前对于氚水浓度高低划分的标准尚未统一，且不同国家之间差异显著。以饮用水中氚含量的限值为例，欧盟大部分国家的标准为1×102Bq/L，加拿大为7×103Bq/L，俄罗斯为7.7×103Bq/L，芬兰为3×104Bq/L，澳大利亚为＞7.6×103Bq/L[13]。同时，核电站排放的氚水浓度通常为1×106Bq/L[14]。对于在内陆建造的核电站，我国要求其排放口下游1 km 处受纳水体中氚浓度不超过1×102Bq/L[15]。因此，本文综合环境因素选取低剂量氚水暴露浓度为1×102和1×105Bq/L。

由于低剂量氚水的生物效应不易被观察到，一些研究者通过构建更为敏感的动物模型，如转入Rev1 基因的C57BL/6N 小鼠、转染人源X 染色体的Hprt 基因缺失的仓鼠细胞等对低剂量氚水的生物效应进行研究[16-17]。然而这些模型目前并不适用于低剂量氚水长期暴露的生物效应研究。斑马鱼作为一种理想的实验动物模型被广泛应用于氚水的毒性效应研究中，且由于其体型小、养成周期短、产卵量大、胚胎透明、成本低等优势十分适合用于氚水长期暴露的生物效应研究[18-19]。Li 等[20]研究发现，氚水对斑马鱼胚胎的行为、生理和基因的表达产生综合影响。Arcanjo 等[21-22]研究发现，氚水暴露后斑马鱼幼苗参与肌肉收缩、眼晶体透明度、DNA 损伤修复的基因出现错误表达。虽然上述研究中的氚水浓度均高于本实验设置的浓度，但是考虑斑马鱼作为模型动物的优势，可以对其在低浓度氚水暴露方面的研究进行探索。

本研究中，在低剂量氚水长期暴露的条件下，与0 Bq/L 氚水暴露组相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露组F1 代斑马鱼的孵化率、自主运动、心率、体长、产卵量等指标的差异均无统计学意义，说明斑马鱼在1×102、1×105Bq/L 浓度的氚水中仅暴露到F1 代并未对其基本生长发育造成影响。目前，氚水长期暴露的生物效应的相关研究较少，一些发现氚水暴露对斑马鱼生长发育指标产生影响的研究中所设置的氚水浓度较高且均为急性暴露[20,23]，因此本实验结果仍需做进一步研究。

氧化应激相关指标（ROS、SOD、MDA 等）在氚水的毒性效应评价中得到了广泛应用，但不同浓度氚水暴露的生物效应仍不明确[12]。Huang 等[24]对在3.7×106Bq/L 氚水中暴露96 h 的小球藻和莱茵衣藻的氧化应激相关指标进行检测，结果表明，小球藻的ROS 荧光强度增加、SOD 含量降低，MDA含量无明显变化；莱茵衣藻的ROS 荧光强度、SOD含量、MDA 含量均无明显变化，与之前的研究结果[25]不一致，他们认为可能是由于氚水的暴露浓度与时间不一致所致。Gagnaire 等[26]对在1×108Bq/L氚水中暴露的斑马鱼进行了ROS 检测，结果表明，鱼龄为4 d 的斑马鱼的ROS 荧光强度增加，但是鱼龄为7 d 和10 d 的斑马鱼的ROS 荧光强度无明显变化。本研究中，与0 Bq/L 氚水暴露组比较，1×102Bq/L 氚水暴露组斑马鱼的ROS 荧光强度、T-SOD 含量、MDA 含量的差异均无统计学意义；1×105Bq/L 氚水暴露组60 d 的 F1 代斑马鱼的MDA含量降低。因此仍需就相关指标做进一步研究。

1×105Bq/L 氚水暴露组60 d 的F1 代斑马鱼体内的总氚含量为（32.23±1.97） Bq/g。其他浓度氚水和暴露时间的样品未检测到明显的氚含量积累，其原因可能为样本中的氚含量过低或低本底液闪计数器的检测性能不足所致。斑马鱼体内氚含量的明显积累提示氚水长期暴露可能会对斑马鱼产生一定影响，较多研究结果均表明相同氚含量下有机结合氚比游离氚产生的生物效应更加显著[23,27-29]。后续需要对氚水的暴露时间、暴露浓度、测量指标等做进一步优化，以更好地观察氚水长期暴露的毒性。

本研究依据核电站实际排放核废水的标准及环境水体中氚浓度的变化设置了氚水浓度，并以斑马鱼为实验模型对该浓度氚水长期暴露所致F1 代斑马鱼的生物效应做了初步探讨。未来应对氚水长期暴露斑马鱼子代作进一步研究，观察F1 代后续子代的各项指标以进一步明确低剂量氚水长期暴露的生物效应，为环境评价和生物健康提供完善的参考数据。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 顾鹏诚负责现场实验的实施、论文的撰写；罗发坚、薛惠元负责实验模型的建立、数据的收集与分析；陈娜、孙亮、万骏负责实验思路的提出与实验设计的指导；崔凤梅、涂彧负责论文的审阅与修改