响应面耦合遗传算法优化超声辅助酶法提取红枣多酚工艺

李哲斌

（商丘职业技术学院 食品工程学院，河南商丘 476100）

0 引言

红枣是枣属植物枣树（Ziziphus jujuba Mill.）的成熟果实，已有4 000 多年的种植历史。红枣具有多种活性成分如多糖、多酚、膳食纤维和三萜酸等。红枣多酚（Polyphenols from Jujube，PPJ）作为红枣中主要的活性组分［1］，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和保护心脑血管等功效［2］。因此，关于PPJ 的研究越来越受到学者们的广泛关注。

利用高效环保的工艺提取活性成分是当前研究的热点。目前，红枣中活性成分的提取分离主要依靠传统工艺，如溶剂提取，该技术存在提取周期长、污染严重等诸多弊端［3］，很难满足当前红枣加工行业可持续发展的需求。超声辅助技术是一种新型的绿色提取技术，基于超声波的空化效应、机械效应和热效应，能够有效地促进植物细胞壁的破坏，加速活性成分的扩散，提升活性成分得率［4-5］。该项技术已经在植物多酚、黄酮和多糖等活性成分提取中得到广泛的应用［6-8］。细胞壁中绝大多数成分是纤维素和果胶，纤维素酶和果胶酶处理植物细胞壁，可以使植物细胞壁破裂降解，显著加速细胞中的活性成分由内向外扩散，提高活性成分的提取效率。然而，超声辅助酶法提取工艺在PPJ 提取领域未见报道。除提取技术外，PPJ 提取率还取决于许多其他因素（溶剂性质、温度、时间和超声强度等）。因此，优化PPJ 的提取工艺是提高PPJ 的提取效率，加速红枣产业发展的关键。响应面法（Response Surface Method，RSM）是一种重要的数学统计工具，常被应用于优化活性物质的提取工艺，但RSM 的缺陷在于对试验点的选择有很高的要求。将RSM 与遗传算法（Genetic Algorithm，GA）结合，即响应面耦合遗传算法（Response Surface Method Coupled Genetic Algorithm，RSMCGA），能在优化提取工艺方面取得较好的预测值和试验优化效果。

因此，本文采用超声辅助酶法提取技术对PPJ 进行提取，探究超声功率、提取温度、乙醇浓度、果胶酶剂量和时间对PPJ 提取率的影响，并利用RSM 耦合GA 优化PPJ 的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红枣产自新疆和田；没食子酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、石油醚、碳酸钠、福林酚试剂购于重庆川东化工（集团）有限公司。

1.2 仪器与设备

Scientz-T 型超声波提取机（宁波新芝生物）；FD-1A-50 型真空冷冻干燥机（江苏天翎仪器）；DF-8 型真空抽滤机（上海保玲仪器）；TGL-16.5M 型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪）；DK-98-II 型电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器）；UV1800 型准双光束紫外/可见分光光度计（上海让奇仪器）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

将新鲜的红枣清净后剔除枣核，切成均匀的小块，放在60 ℃烘干机中干燥，以除去多余水分；然后将干燥的红枣块用粉碎机粉碎，过40 目筛，将获得的红枣粉末置于自封袋中密封，在4 ℃环境下保存备用。

1.3.2 超声辅助酶法提取PPJ

准确称取5.0 g 红枣粉末，添加到具塞烧瓶中，按照料液比1：30 g/mL 加入不同浓度的乙醇，与样品充分混合；然后再按照不同剂量加入果胶酶，用超声波提取仪处理混合体系并完成提取过程，于7 000 r/min 转速下离心作用15 min。抽滤后获得滤液，并在旋转蒸发仪中对滤液进行浓缩，温度控制在40 ℃，浓缩液冻干后得到PPJ 粉末。

1.3.3 PPJ 提取率测定

参考HUANG 等［9］的测定方法，计算不同提取条件下PPJ 的提取率。取1 mL 提取所得PPJ于25 mL 具塞试管中，分别加入2 mL 10%福林酚试剂和10 mL 10%碳酸钠溶液，加入纯水定容到25 mL，混合均匀；然后置于50 ℃水浴锅中避光反应1 h，以蒸馏水作对照，在波长为766 nm 处测定样品吸光值，并通过下式计算PPJ 的提取率（β）：

式中 C——PPJ 浓度，g/mL；

V——PPJ 体积，mL；

m——干燥的红枣固体粉末重量，g。

1.3.4 单因素试验

选择超声辅助酶法作为提取PPJ 的方法，在超声功率、提取温度、乙醇浓度、果胶酶剂量和提取时间5 个因素条件下开展单因素试验，讨论各个试验因素对样品多酚提取率的影响。超声功率分别为100，200，300*，400，500 W；提取温度分别为30，35，40*，45，50 ℃；乙醇浓度分别为40%，50%，60%*，70%，80%；果胶酶剂量分别为0.10%，0.15%，0.20%*，0.25%，0.30%；提取时间分别为10，20，30*，40，50 min。其中“*”代表在研究其他试验因素对PPJ 提取率影响时，保持不变的试验因素。

1.3.5 响应面法试验

基于单因素试验结果，以超声功率（α1）、提取温度（α2）、乙醇浓度（α3）和果胶酶剂量（α4）为自变量，以β为响应值。根据响应面试验原理设计并开展组合试验。

利用响应面分析法得到二次回归模型，如下式所示：

式中 b0，bi——分别为截距、线性回归系数；

bii，bij——分别为二次项、交互项的回归系数；

αi，αj——自变量。

1.3.6 遗传算法设计遗传算法依据达尔文进化论演变而来，具有全局寻优的功能，可以经过无数次迭代逼近最优结果，适用于优化不同参数下获得目标成分的最大提取率［10］；可以避免试验因素水平选择不当，得不到理想的优化结果。具体优化参数程序：根据单因素试验所得的结果，设置α1，α2，α3，α4试验因素作为决策变量，即：

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选择各试验因素水平的取值范围，PPJ 提取率最佳的约束条件：200 W ≤α1≤400 W；30 ℃≤α2≤40 ℃；50%≤α3≤70%；0.15%≤α4≤0.25%。

1.4 数据处理

每组试验重复3 次，以平均值±标准差（mean±SD）来表示试验结果；采用SPSS8.0 软件对每组试验数据进行方差分析和试验结果的显著性差异分析；利用Origin9.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素对PPJ 提取率的影响

各因素对PPJ 提取率的影响见图1。当α1在100～300 W 时，随着α1的增加，PPJ 提取率显著提升（P＜0.05）。当α1为300 W 时，PPJ 提取率达到最大值（0.66%±0.005%）。主要原因在于α1的增加会增强超声空化效应，PPJ 易由内向外扩散，能够有效促进PPJ 的提取［11］。当α1＞300 W 时，α1的增加会显著降低PPJ 提取率（P＜0.05）。归因在较大的α1条件下，PPJ 的化学结构可能会被破坏，并且杂质溶解较多，导致PPJ提取率下降［12］。这与曹艳华等［13］研究超声提取洋葱多酚结果类似。因此，后续试验在α1为200，300，400 W 下进行。

图1 不同试验因素对PPJ 提取率的影响Fig.1 Effect of different experimental factors on jujube polyphenol extraction rate

随着α2的升高，PPJ 提取率先显著增加后显著降低（P＜0.05），当α2为40 ℃时，PPJ 提取率达到最高值（0.69%±0.004%）。其原因是随着α2的升高，一方面增加PPJ 在溶剂中的溶解度，降低传质阻力，促进PPJ 的扩散；另一方面有利于提高果胶酶催化活力，加速植物细胞壁的破坏，促进多酚从细胞内溶出，提高多酚提取率［14］。但当α2过高时，可能降低果胶酶活性甚至使其完全失活，还可能破坏多酚结构，从而降低PPJ 的提取率［15］。因此，后续试验在α2为30，35，40 ℃下进行。

随着α3的增加，PPJ 的提取率先显著增加后显著降低（P＜0.05），当α3为60%时，PPJ 提取率取得最大值（0.68%±0.008%）。其原因是当α3为60%时，PPJ 极性与乙醇极性相似，此时PPJ 溶解性最强，能够达到最大的提取率［16］。当α3超过60%，高浓度的乙醇会促使其他醇溶性杂质或色素等被溶进反应体系。此外，α3越高，越容易破坏细胞膜的完整性，阻碍PPJ 的溶出，导致PPJ提取率下降［17］。因此，后续试验在α3为50%，60%，70%下进行。

当α4在0.10%～0.15%时，PPJ 提取率随α4增加显著增加（P＜0.05）。其原因是随着α4增加，果胶酶催化能力增强，使植物细胞壁发生降解，有利于PPJ 的扩散，使PPJ 的提取率提升［18］。但当α4超过0.15%时，随着α4的增加，PPJ 提取率显著降低（P＜0.05）。该结果与TAN 等［19］采用超声辅助酶法提取葡萄皮花色苷结果一致。因此，后续试验在α4为0.15%，0.20%，0.25%下进行。

当α5在10～30 min 时，PPJ 提取率随α5延长显著增加（P＜0.05）。这是由于在提取的初期，空化效应会诱导细胞内多酚逐渐向外扩散，使得PPJ 提取率不断提高［20］。但当α5超过30 min 时，由于细胞内大多数PPJ 已经溶出，再延长时间对PPJ 提取率的变化无显著影响（P＜0.05）。因此，后续试验将α5设置为30 min。

2.2 响应曲面法试验结果

2.2.1 模型建立与显著性检验

表1 响应曲面法试验设计及结果Tab.1 Experimental design and results of response surface method

对回归方程系数进行显著性检验，其结果见表2。由表2 可知，回归系数R2=0.890 7，F=8.15，P=0.000 2。由于失拟项P=0.374 6＞0.05，说明模型的失拟项不显著，表明通过RSM 方法建立的数学模型能够较好地拟合试验数据。

表2 PPJ 工艺优化回归模型系数的显著性检验报告Tab.2 Significance test report of regression model coefficient of jujube polyphenol process optimization

F 值是判断试验因素对响应值影响是否显著的有利工具。F（α1）=11.39，F（α2）=0.030，F（α3）=20.95，F（α4）=7.475×10-3，即各试验因素对PPJ提取率的影响顺序为α3＞α1＞α2＞α4。

对RSM 模型进行充分性检验。由图2（a）可知，试验得到的PPJ 提取率的真实值与预测值基本一致。说明RSM 模型可以用来测算各提取工艺条件下的PPJ 提取率。图2（b）显示，PPJ 提取率均满足正态分布，且未出现偏离方差。由图2（c）可看出，各个试验点的学生化外残差范围均控制在±3 范围内。图2（d）显示，简化多项式模型的Cook’s 距离均分布在1.0 以内。充分性检验可以进一步验证采用GA 法优化超声辅助酶法提取PPJ 的可行性。

图2 RSM 模型充分性检验图Fig.2 RSM model adequacy test diagram

2.2.2 交互项分析

各因素交互作用的响应面和等高线图如图3所示。结合图3 和表2 的结果可知，α1α2，α1α3，α1α4，α2α4，α3α4的两两交互作用均对β无明显影响（P＞0.05），故不进行深入分析。由图3（a）可知，β存在极值点；图3（b）的等高线图呈椭圆形，表明α2α3的交互作用会显著影响β（P＞0.05）。由此可知，各因素对β的影响顺序为α3＞α1＞α2＞α4，与方差分析的结果相符。

图3 各试验因素交互作用的响应面和等高线Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.2.3 PPJ 提取工艺参数优化

利用Matlab R2018b 软件中的GA 优化工具箱分析优化试验数据，迭代143 次，PPJ 提取率达到最高值，此时α1，α2，α3，α4水平编码分别为1，-1，1，-1，对应的试验水平分别为400 W，30 ℃，70%，0.15%，在此条件下，所得β的理论值为0.94%。

2.2.4 试验验证

为验证GA 法的可靠性，在以上试验所得到的各试验因素水平上进行3 次重复试验，所得PPJ 提取率为0.90%±0.01%，试验数值和理论数值之间的相对误差为4.26%。说明GA 可较好地测算PPJ 提取率，同时也证明采用RSMCGA 优化PPJ 提取的技术工艺可行。

3 结语

本文通过RSMCGA 优化超声辅助酶法提取PPJ 工艺，在超声功率为400 W，提取温度为30 ℃，乙醇浓度为70%，果胶酶剂量为0.15%，提取时间为30 min 的工艺参数条件下，具有最佳的提取效果，PPJ 的提取率达到0.90%±0.01%。表明RSMCGA 可较好地测算PPJ 提取率，通过RSMCGA 优化PPJ 的提取工艺参数可行。研究结果将会为PPJ 的提取和相关产品的开发提供一种绿色高效的解决方案。