瑶药黄钻总三萜超声辅助提取工艺优化及抗氧化、抑菌性研究

郭 松，农 斌，梁湘兰，陈杨匀

（1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西来宾 546199；2.广西科技师范学院 壮瑶药品质生物学重点实验室，广西来宾 546199）

0 引言

瑶药黄钻基源植物为翼梗五味子（Schisandra henryi C.B.Clarke），属五味子科五味子属。瑶药黄钻根茎部分可入药，收录于《中华人民共和国药典》。黄钻是瑶医药谱中“十八钻”之一，有活血止血、祛风散寒和消肿止痛的功效［1］。药物研究发现，多数的五味子属药材所含的可药用化学成分多种多样，其中目前已开发的药用有效成分主要是三萜类、木脂素类和挥发油等［2］。

三萜类化合物是黄钻中主要的药用活性成分之一［3］，具有高度的结构多样性和广泛的生物活性［4］，可以分为多个不同种类，包括半夏酮、黄芩素、三七甙和肉桂酮等［5］。药用三萜类天然产物具有多种药理活性，包括降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和抑菌等［6］。三萜类成分的提取分离常用的方法有超临界流体萃取法、超声辅助提取法等［7］。超声辅助提取技术是一种基于声波作用的无污染、高效的物质提取技术，近年来在中药提取领域得到广泛的应用［8］。超声波作用使溶剂和被提取物质之间形成微小气泡，破坏样品细胞的细胞壁和细胞膜结构，使得生物活性物质更容易释放［9-10］。因此，超声辅助提取技术是一种方便且高效的提取方法，具有提高提取效率、节能环保和减少试验成本等优点，是一种具有很大潜力的提取方法［11］。

本文旨在优化瑶药黄钻总三萜的超声辅助提取工艺，对黄钻总三萜的抗氧化和抗菌生物活性进行分析，以提高其提取效率和生物利用率，为瑶药黄钻的开发利用提供一定的科学参考。

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器

R-1001VN 型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；KH-100DE 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；ATY224 型电子天平（岛津菲律宾工厂）；H1850 型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；WJX-100 型高速多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）；V-5600 型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；HH-4 型恒温水浴锅（常州天瑞仪器有限公司）。

1.2 试剂与材料

瑶药黄钻购置于广西壮族自治区金秀瑶族自治县瑶医医院，随后保存于实验室。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌ATCC 菌株，环凯生物集团；齐墩果酸标准品，上海麦克林生化科技股份有限公司；乙醇、香草醛、甲醇、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲基亚砜等常规试剂均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

2 试验方法

2.1 试验材料预处理

将黄钻自然风干，切成小片，使用粉碎机进行细磨，过100 目筛网，存放在密封袋中，放置于阴凉干燥处备用。

2.2 齐墩果酸标准曲线的绘制

精确称取0.020 0 g 齐墩果酸标准品，将样品溶解于甲醇中，用100 mL 容量瓶稀释至刻度线，制备出0.2 mg/mL 的标准品溶液。取6 支10 mL试管，分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 的标准品溶液，将试样放置于60 ℃的水浴中加热，直至完全蒸干。冷却至室温后，加入0.2 mL 新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液（称取0.250 0 g 香草醛，加入5 mL 冰乙酸溶解），以及0.8 mL 高氯酸。在60 ℃水浴中加热15 min 后，试样显色。将试样放入冰水浴中冷却5 min，取出后加入冰乙酸至5 mL，相应试剂作空白对照，在560 nm 波长处测定吸光度，平行测定3 次，取平均值［12］。以吸光度值为纵坐标，齐墩果酸质量浓度为横坐标，用Origin 作图软件绘制标准曲线。

2.3 黄钻总三萜得率的计算

经试验得到的黄钻总三萜超声提取液按照试验操作步骤，测定样液吸光度值，并将吸光度值代入标准曲线回归方程计算总三萜含量［13］。按照下式计算总三萜得率：

式中 Y——总三萜得率，%；

M—— 样品吸光度值在标准曲线上所对应的总三萜质量，mg；

n——稀释倍数；

m——样品质量，g。

2.4 超声辅助提取黄钻总三萜单因素试验

2.4.1 溶剂种类对黄钻总三萜提取率的影响

取3 份1.000 0 g 的黄钻粉末以1：50 的料液比分别与甲醇、乙醇、乙酸乙酯混合均匀，在超声波清洗机中40 ℃水温超声辅助提取30 min，所得提取液经过8 000 r/min 离心作用15 min，取上清液0.2 mL 各3 管，60 ℃水浴挥干，冷却后加入0.2 mL 新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液、0.8 mL的高氯酸做显色剂［14］，将样品在60 ℃水浴锅中显色15 min，取出后进行5 min 冰水浴冷却，加入冰乙酸至5 mL 刻度线，用相应试剂做空白对照，在560 nm 波长处测定吸光度值。

2.4.2 料液比对黄钻总三萜提取率的影响

根据单因素试验结果，选择甲醇作为后续的试验溶剂。准确称取1.000 0 g 的样品，与100%甲醇分别按照1：10，1：20，1：30，1：40，1：50 的比例混合制成混合物；然后在40 ℃的超声辅助下提取30 min；最后测定吸光度值并计算黄钻总三萜提取率。

2.4.3 溶剂浓度对黄钻总三萜提取率的影响

精确称取1.000 0 g 黄钻粉末，溶剂种类与料液比按上文确认，分别与60%，70%，80%，90%，100%的甲醇混合，40 ℃超声辅助提取30 min，提取后测定其吸光度值，并计算黄钻总三萜提取率。

2.4.4 超声时间对黄钻总三萜提取率的影响

精确称取1.000 0 g 黄钻粉末，溶剂种类、料液比和溶剂浓度按上文确认，分别超声辅助提取20，30，40，50，60 min，提取后测定吸光度值，并计算黄钻总三萜提取率。

2.5 Box-Behnken 响应面试验设计

根据单因素试验结果，利用响应面设计软件的Box-Behnken 对黄钻的超声辅助提取条件进行优化。因子编码及水平见表1。

表1 因素水平编码表Tab.1 Factor level coding table

2.6 黄钻总三萜总抗氧化能力的测定

2.6.1 总三萜的提取

根据上述的试验结果，以最佳工艺条件进行总三萜的提取。设定提取目标为1.000 0 g 的三萜类化合物，开始进行超声提取3 次，并计算提取率。将所得提取液倒入旋蒸瓶旋蒸，当瓶中溶液开始浓稠时，移入提前称好空瓶重量的小号旋蒸瓶继续旋蒸。直至提取物呈现膏状，适当降低旋蒸温度后继续旋蒸，当瓶中溶剂蒸干后停止。用10 mL 的20%二甲基亚砜将提取物溶解，将旋蒸瓶沥干后称量瓶壁固体物和瓶体的总重量，确定提取物的质量。

2.6.2 总抗氧化能力标准曲线的制作

标准品：10 mg FeSO4·7H2O 加入0.9 mL 蒸馏水和20 µL 浓硫酸，配制成40 µmol/mL FeSO4标准溶液备用。

混合液：将试剂盒中的试剂一、试剂二、试剂三按7：1：1 的比例混合，现配现用。使用前置于37 ℃恒温水浴锅中预热10 min［15］。

按照试剂盒使用方法，在593 nm 波长下测定吸光度值，并绘制标准曲线。

2.6.3 总抗氧化能力的测定

将提取物配制成梯度浓度的样品溶液。取5支离心管，在每支管中各加入180 µL 的混合液和18 µL 的样品溶液，接着加入90 µL 的蒸馏水，混匀后避光反应10 min，593 nm 波长处测定吸光度值，以VC 为对照，比较总抗氧化能力。

2.7 黄钻总三萜抑菌能力研究

2.7.1 培养基的制备

配制牛肉膏蛋白胨培养基的配方：氯化钠5.000 0 g、牛肉膏3.000 0 g、蛋白胨10.000 0 g 和琼脂粉20.000 0 g。将这些成分溶解在蒸馏水中，定容至1 000 mL。pH 值调整至7.2～7.4，充分混合后，置于高压蒸汽灭菌锅中进行121 ℃灭菌20 min。待冷却后，将培养基倒入平板中制成培养基平板，并在4 ℃下保存备用［16］。

液态培养基的制备方式与固态培养基相同，只是在培养基配方中不加入琼脂粉，进行121 ℃高压蒸汽灭菌30 min［17］，取出冷却，4 ℃保存备用。

2.7.2 抑菌圈测定

当具有抑菌作用的样品在固体培养基上扩散时，会在培养基表面形成1 个圆形区域，杀死周围的细菌或抑制其生长，该区域被称为抑菌圈［18］。通过测量抑菌圈的大小可以评估样品的抑菌能力［19］。

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别属革兰氏阳性和阴性菌。在阳性对照中选择氨苄青霉素钠，在阴性对照中选择硫酸链霉素盐［20］。首先将总三萜样品用无菌水稀释成10 mg/mL 的溶液；然后将经过灭菌处理的直径为6 mm 的干燥滤纸片浸泡在其中；接着制备0.01 mg/mL 的抗生素溶液并同样将滤纸片浸泡其中；最后吸取200 µL 的菌悬液涂布在固体培养基上，使其均匀分布，将泡于样品溶液、抗生素溶液、无菌水中的滤纸片取出，挥干后放在培养基表面，做好标记，37 ℃培养箱中培养24 h。培养完成后取出，用尺子测量抑菌圈直径，当抑菌圈＞6 mm 时，说明样品具有一定的抑菌能力。

2.7.3 最小抑菌浓度测定

将样品溶液配制成4 个不同的梯度：100，50，25，12.5 mg/mL，同时准备0.1 mg/mL 的抗生素溶液。取6 支玻璃培养试管，各加入4 mL 的液体培养基，200 µL 的菌悬液，按梯度分别加入200 µL的样品溶液，同时进行1 组阳性对照试验（不加样品溶液，加抗生素溶液）和空白试验（只有菌悬液）。混合均匀后用保鲜膜密封在37 ℃培养箱中培养24 h，然后观察溶液的浑浊度。当1 支试管内的溶液澄清，上一梯度浓度的试管溶液混浊，则该梯度的总三萜浓度即为最小抑菌浓度（MIC）［21］。

2.8 数据处理

所有试验均重复3 次，采用Excel 2016 和Origin 2018 进行试验数据处理、分析及绘图。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的建立

图1 为齐墩果酸标准曲线，其线性回归方程为y=0.002 9x+0.124 3，R2=0.996 4，线性关系良好，表明该方程可用于计算所提取的黄钻总三萜质量。

图1 齐墩果酸标准曲线Fig.1 Standard oleanolic acid curve

3.2 单因素试验结果分析

3.2.1 不同溶剂对提取率的影响

以甲醇、乙醇、乙酸乙酯为溶剂提取时，甲醇作为溶剂对黄钻总三萜的提取率均高于乙醇和乙酸乙酯。同时，醇类有机溶剂的提取率优于乙酸乙酯。

3.2.2 不同单因素对提取率的影响

由图2 可知，当料液比达到1：30 时，提取率达到最大值。当溶剂浓度较低时，黄钻样品与溶剂接触面小，导致提取效果不佳；料液比达到最佳比例时，溶剂与黄钻样品充分混合，在超声辅助提取时，两者有效碰撞面积最大，提取率达到最大值；若继续增大料液比，会导致在超声辅助提取时，样品与溶剂的有效碰撞面积逐渐减少，导致最终的总三萜提取率降低［22］。综合考虑试验简便性、高效性和资源节约等因素，选择黄钻样品与溶剂1：30 的料液比进行后续试验。

图2 不同单因素对提取率的影响Fig.2 Influence of different single factors on extraction rate

适当的有机溶剂浓度有利于总三萜的溶出，过高或过低会导致竞争性成分溶出，或总三萜溶出减少，从而导致提取率降低［23］。当甲醇浓度达到70%时，黄钻总三萜提取率最大。甲醇浓度较低时提取效果不佳，若甲醇浓度继续增加，黄钻总三萜提取率下降。综合试验结果，选择甲醇浓度为70%的溶剂做后续的提取条件。

在超声时间达到40 min 时，有最佳的总三萜提取率。研究表明，提取时间过长或过短都会导致总三萜提取率变低［24］。因此，选择40 min 的超声时间作为后续试验的提取条件。

3.3 响应面结果分析

根据单因素试验结果，选择料液比（A）、甲醇浓度（B）、超声时间（C）为3 个自变量，总三萜提取率为响应值（Y），设计3 个水平，以随机顺序进行15 次试验。对试验结果进行拟合分析，建立黄钻总三萜提取率与自变量的关系模型。该模型表达式：Y=1.26-0.092 5A+0.113 7B+0.058 8C-0.022 5AB+0.062 5AC-0.03BC-0.376 7A2-0.299 2B2-0.234 2C2。

对模型进行方差分析，如表2 所示。模型P＜0.000 1＜0.01，表明模型极显著；失拟项表明模型与试验结果之间的拟合程度，失拟项的P＞0.050，方差不显著，说明模型与试验的拟合程度良好，试验误差小。计算得模型的CV=4.06%，说明模型可信度较高，可用以预测黄钻总三萜的提取率；相关系数R2=0.995 7，表明试验与预测值之间的拟合程度良好，即黄钻总三萜得率的变化99.57%来自于所选试验条件；经计算校正系数Radj2=0.987 8，说明模型可以解释98.78%的黄钻总三萜提取率的变化［25-27］。

表2 方差分析表Tab.2 Variance analysis table

由回归方程各项方差可知，一次项A，B，C 对试验结果的影响极显著（P＜0.01）；交互项AC 显著（P＜0.05），AB，BC 不显著（P＞0.05）；二次项A2，B2，C2都极显著（P＜0.01）。以上各项的显著性都表明，各试验因素与黄钻总三萜提取率之间不是简单的线性关系。表中各项试验因素的F值表示该因素对响应值的影响大小，F值越大表明该因素对响应值的影响越大，因此影响总三萜提取率的因素顺序为甲醇浓度＞料液比＞超声时间。

为确定各个因素及其交互作用对黄钻总三萜提取率的影响，根据回归方程绘出相应的响应面图，如图3 所示。等高线排列紧密且形状呈椭圆形，表明图中所示的2 个因素交互作用显著；排列疏松且呈现圆形，则表明2 个因素交互作用不显著。响应面图中曲线的坡度反应交互作用的影响，曲面坡度越大说明影响越显著，曲面坡度越平缓说明图中2 个因素对提取率的影响越不显著。图中的颜色深浅反应总三萜提取率的变化情况。

图3 各因素间交互作用的响应面图Fig.3 Response surface plots showing the interactions of various factors

料液比与超声时间的响应面图坡面陡峭程度最大，具有最高的提取率点；等高线相较于其他2 组，呈更为规整的椭圆状，达到显著水平（P＜0.05）。通过分析料液比与甲醇浓度、甲醇浓度与超声时间的等高线与响应面图，发现其两两之间的交互作用不强，对提取率影响不显著（P＞0.05），且甲醇浓度与超声时间的交互作用强于料液比与甲醇浓度，这与方差分析表中的结果相符合。

结合方程进行预测，黄钻总三萜的超声辅助提取工艺的最佳条件：料液比1：28.79 g/mL，甲醇浓度71.89%，超声时间40.97 min，预测的最大提取率为1.282%。考虑实际操作简便性，最终确定提取工艺条件：料液比1：29 g/mL，甲醇浓度72%，超声时间41 min，根据此条件进行3 次验证试验，黄钻总三萜平均提取率为1.275%，与模型预测值相接近，说明模型具有实际指导意义。

3.4 抗氧化能力结果与分析

3.4.1 总三萜浸膏的获取

通过膏浸物的溶解，算出提取到的总三萜物质纯化物为0.700 0 g，考虑到旋蒸及溶解过程中的损失，该数值合理。取1 mL 溶解所得到的溶液，分别用20%的二甲基亚砜稀释到测定总抗氧化能力所需的浓度梯度，以备后续试验。

3.4.2 总抗氧化能力测试

采用试剂盒法测定待测物质还原Fe3+离子的能力，从而评估物质的总抗氧化能力。按照方程：y=20.753x-0.005 8，R2=0.999 3，计算黄钻总三萜的总抗氧化能力。如图4 所示，三萜类物质虽具有抗氧化能力，但其抗氧化能力与VC 对照品相差较大，处于相同浓度梯度上的样品与VC 呈现2 种不同变化状态。VC 总抗氧化能力随着浓度的增加而明显变大，而该梯度范围内的样品总抗氧化能力保持在2～4 µmol/mL。

图4 总抗氧化能力和与VC 的对比Fig.4 Total antioxidant capacity and comparison with VC

3.5 抑菌能力结果分析

3.5.1 对大肠杆菌抑菌能力结果分析

图5 为大肠杆菌抑菌圈测定结果。样品溶液的滤纸片周围出现较为明显的抑菌圈，但较抗生素滤纸片周围的抑菌圈小，即总三萜样品对大肠杆菌有抑制作用，但弱于抗生素。图6 为总三萜对大肠杆菌的最低抑菌浓度测定结果。6 号空白对照管混浊有菌生长；5 号阳性对照管澄清透明，抑菌效果显著；4 号管为无抑菌效果；其上一梯度样品溶液所代表的3 号管内澄清透明，抑菌效果明显，故3 号管样品浓度25 mg/mL 为黄钻总三萜对大肠杆菌的MIC。

图5 大肠杆菌抑菌圈试验组Fig.5 Experimental group of E.coli bacteriostatic zone

图6 大肠杆菌最低抑菌浓度试验组Fig.6 Experimental group of minimum inhibitory concentration of E.coli

3.5.2 对金黄色葡萄球菌抑菌能力结果分析

图7 是金黄色葡萄球菌抑菌圈试验结果。样品滤纸片的培养基表面没有出现明显的抑菌圈。阳性对照组的抑菌圈效果明显优于试验组，说明总三萜对金黄色葡萄球菌并无明显的抑制作用。由于在金黄色葡萄球菌的抑菌圈试验中，总三萜对金黄色葡萄球菌没有抑制效果，所以后续不再对金黄色葡萄球菌进行MIC 测试。

图7 金黄色葡萄球菌抑菌圈试验组Fig.7 Experimental group of S.aureus bacteriostatic zone

4 结语

通过优化黄钻中总三萜的提取方法，为传统医药材的现代化科学利用提供相应的研究办法，同时也为黄钻有效成分的提取提供一种更新、更好的选择。通过对料液比、甲醇浓度、超声时间3个因素的研究分析，建立超声辅助提取黄钻总三萜的数学模型，得到响应面图。方差分析表明，模型可信度高，具有实际可操作性，可用于对样品提取率的预测。黄钻总三萜最佳提取工艺条件：料液比1：29 g/mL，甲醇浓度72%，超声时间41 min，此时提取率为1.275%。通过对黄钻总三萜的总抗氧化能力进行测定，结果表明，黄钻总三萜具有良好的抗氧化能力，但弱于VC。对黄钻总三萜的抑菌活性进行研究，发现对大肠杆菌有较为明显的抑制作用；25 mg/mL 的总三萜溶液即可阻碍大肠杆菌生长。对于金黄色葡萄球菌，并未发现有明显的抑制作用。