盘锦地区中华绒螯蟹养殖及越冬期间的“牛奶病”发病特点调查

刘芳　刘乃更　杨占全　梁芳　邢冬飞　李让　耿丹　孙娜

摘 要：近几年辽宁盘锦地区河蟹“牛奶病”暴发，给养殖户造成较大的经济损失。为了调查“牛奶病”的发病特点及规律，2022年7～9月份对盘锦地区的中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）稻田养殖过程进行了“牛奶病”的监测与调查。2022年12月及2023年2月对不同扣蟹越冬暂养密度、不同越冬模式的扣蟹“牛奶病”发病情况进行了调查。结果显示，在稻田养殖阶段9月份为主要的发病时间，且成蟹养殖阶段的发病率高于扣蟹养殖阶段，扣蟹越冬暂养期间暂养密度越大，“牛奶病”患病率越高。越冬前挑选雌雄的过程会增加“牛奶病”患病率。该研究为中华绒螯蟹养殖及越冬暂养期间的“牛奶病”预防和控制提供数据支持。

关键词：中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）；扣蟹养殖；成蟹养殖；扣蟹越冬；二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）

中图分类号：S945.6文献标志码：A

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）又称河蟹，是中国重要的淡水养殖经济品种之一[1]，广泛分布于湖泊、水库，深受广大消费者喜爱。2020年的《中国渔业统计年鉴》显示，中华绒螯蟹在国内养殖产量达77.5万t[2]。目前，辽宁省盘锦市已成为中华绒螯蟹重要的养殖中心，养殖面积11.3万hm2，产品产值40亿元。 2019年，其成蟹和幼蟹产量分别为5.2万t和2.55万t，分别占中国总产量的6.7%和37.5%。中华绒螯蟹牛奶病是近几年在中国北方地区河蟹养殖时暴发的病害，患病蟹检查发现肝胰腺和血淋巴已病变成乳白色，逐渐活力减弱不能摄食，最终死亡，给蟹苗养殖户造成严重的经济损失[3]。马红丽、孙娜等对病蟹进行了组织病理学检查、病原分离、鉴定，以及人工回感试验，证实辽宁地区中华绒螯蟹的“牛奶病”是由二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）感染所致[4]， 2021年Bao等的研究也证明了河蟹“牛奶病”是由二尖梅奇酵母感染引起的[5]。目前盤锦地区的“牛奶病”感染率逐年上升，严重威胁着河蟹产业的发展[6-7]。孙娜等[3]研究表明，冬季越冬期是河蟹牛奶病的高发期，为了找到越冬期间河蟹的发病特点以及与其相关的因素，2022年对盘锦地区的扣蟹及成蟹养殖过程进行了牛奶病的监测与调查，特别是对不同暂养密度、不同越冬模式的扣蟹发病情况进行了调查，旨在为扣蟹稻田养殖及越冬期间的牛奶病预防和控制提供依据。

1 材料方法

1.1 牛奶病调查与样品采集

2022年7月至2023年2月，在辽宁盘锦稻田河蟹养殖及越冬期间进行调查，采样地点分布在盘锦的王家、坝墙子、新兴、新开、甜水、胡家、唐家、东风、西安、清水10个乡镇（见图1），主要调查内容为不同养殖阶段、不同冬储模式中华绒螯蟹的“牛奶病”发病特征、发病时间和发病率等情况。

1.2  中华绒螯蟹牛奶病调查内容

1.2.1 扣蟹养殖阶段牛奶病调查

于2022年7月至2023年2月进行扣蟹的稻田养殖及越冬期间暂养扣蟹的牛奶病取样调查。取样地点为盘锦市王家镇等10个乡镇的稻田养蟹区与越冬池，取样地点见图1。通过对采集的扣蟹进行“二尖梅奇酵母”涂板检测，统计不同月份各取样地点扣蟹牛奶病患病情况。

1.2.2 成蟹养殖阶段牛奶病调查

于2022年7月至9月进行成蟹稻田养殖期间牛奶病取样调查。取样地点为盘锦市王家镇等10个乡镇的成蟹稻田养殖区。通过对采集成蟹进行二尖梅奇酵母的培养检测，统计出不同月份各取样地点成蟹牛奶病患病情况。

1.2.3 扣蟹冬季不同暂养密度及不同越冬模式调查

为了调查越冬暂养密度对扣蟹牛奶病的影响，于2023年2月份对5个不同暂养密度的15户养殖户扣蟹越冬暂养情况进行了采样调查。通过对不同暂养密度的扣蟹采集进行牛奶病检测，统计出不同密度暂养的扣蟹牛奶病患病情况。由于雌蟹价格高于雄蟹，为了提高冬季暂养的效益，盘锦地区大部分扣蟹越冬农户在越冬前会进行雌雄挑选，选择雌蟹越冬暂养。为了调查挑选操作是否会对“牛奶病”发病产生影响，于2023年2月份对盘锦6个地区进行了挑选与未挑选两种方式的越冬扣蟹患牛奶病情况的调查。通过对越冬前挑选与未挑选的暂养扣蟹取样进行“牛奶病”检测，统计出暂养前挑选对扣蟹越冬牛奶病患病的影响。

1.3 病原检测及鉴定方法

1.3.1 检测方法

将取回的蟹样本在无菌条件下解剖，无菌操作下取肝胰腺接种于孟加拉红培养基 27℃培养 48hrs后，平板上生长出均一菌落，显微镜下表现为酵母形态。

1.3.2 鉴定方法

二尖梅奇酵母鉴定所用特异性引物F： 5’-AGCCTGGTCTTTGTAATG-3’；R： 5’-ACTCCCTTGTTGGTGATA-3’。试剂盒的 PCR反应条件为：预变性94℃，10mins；变性94℃，1min；退火50℃，45s；延伸72℃，1min；终延伸72℃，10mins；其中，变性、退火和延伸为35个循环。待PCR反应结束后，取5μL PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。目的片段大小460bp。

2 结果

2.1 患病症状

牛奶病患病情况分为两种，严重有明显病症的扣蟹运动能力下降，对刺激的反应较弱，壳色变为淡黄色（如图2a）。打开明显病症蟹头胸甲，患病蟹体内蓄积大量牛奶状液体（如图3c），无菌操作分别下取肝胰腺接种于孟加拉红培养基 28℃培养 48hrs后，平板上生长出均一菌落（如图4） ，进一步进行分子生物学鉴定。提取肝胰腺 DNA，进行聚合酶链式反应（PCR） 鉴定，在 460bp处显示为目标条带清晰可见（如图5）。也定义为患病蟹。

2.2 扣蟹养殖阶段牛奶病调查结果

夏季稻田养殖扣蟹的牛奶病情况如表1所示，整体感染率很低，7～9月份的三次取样的扣蟹感染率分别是0%、0%、18%。7月份和8月份取样扣蟹的10乡镇均未检测到病原菌。9月份10个乡镇中，只有王家镇1个稻田发现2只扣蟹感染。

越冬期间池塘扣蟹牛奶病情况如表2所示，整体感染率增加。10个越冬池均有受到感染的扣蟹，感染率最低为4%，最高为40%，12月份扣蟹平均总感染率为13.67%，2023年2月份扣蟹平均总感染率为18.33%，感染率随着越冬时间的延长有升高的趋势。

2.3 成蟹养殖阶段牛奶病调查结果

夏季稻田养殖成蟹的牛奶病情况如表3所示，夏季7月、8月、9月的三次取样的成蟹感染率分别为0.51%、0.68%、5.56%。7月份只有甜水镇一个稻田发现3只成蟹患病，8月份新兴镇一个稻田发现2只成蟹患病，胡家一个稻田发现2只成蟹患病，9月份取样时，王家镇和坝墙子镇的感染率最高，分别为16.13%和10.23%，9月份取样患病户数与患病率均高于7月份和8月份。

2.4 冬季不同暂养密度及不同越冬模式调查

对不同越冬暂养密度的扣蟹患牛奶病情况进行了养殖回访调查，结果如表4所示，发现养殖密度在240kg/亩～260kg/亩时牛奶病患病率最低，平均为7.81%，在养殖密度在1200kg/亩～1300kg/亩时，牛奶病患病率最高，平均患病67.20%，牛奶病患病率与越冬密度呈正相关。

对越冬前挑选与未挑选两种方式的越冬扣蟹患牛奶病情况的调查结果如图5所示，挑选过后的扣蟹患牛奶病率平均为37.21% 未经过挑选扣蟹牛奶病患病率平均为14.71% 。

3 讨论

调查研究表明，室外稻田夏季高温情况下，牛奶病患病率低于越冬期间，这可能是由于夏季6-9月份是河蟹重要的生长期，水体中含有丰富的浮游植物和底栖动物，河蟹通过摄食大量天然饵料，不断吸收营养积累能量，此阶段河蟹的免疫力增强，不易患病，而冬季越冬期河蟹不摄食，免疫力低下，且越冬暂养阶段密度大，更加导致牛奶病传播速度加快。根据朱必陆等[8]多年实践检验表明如果扣蟹在冬季得到较好的培育，来年蜕第一壳、第二壳成活率和增重率都较好，养殖大规格的河蟹比率大，增值效益也较明显。所以怎样降低越冬暂养扣蟹的患病率是对来年稻田养殖成蟹养殖效益非常关键的。

该研究中成蟹在夏季患病率高于扣蟹，同样，LU C C等人[9]研究表明，二尖梅奇酵母在罗氏沼虾中的流行率在成年对虾中最高（73%），其次是幼虾（25%）和后期幼体（2%），并且在幼体中没有发现酵母感染。CHEN S C等[10]认为，虽然成年个体的免疫系统比幼年个体强健，但体型大的个体由于活动力强、生长期长，更容易接触到水体和沉积物中的病原体，这可能是成蟹的牛奶病患病率高于扣蟹的原因。

养殖密度是影响水生动物健康生长和养殖利润的最直接因素，该研究中越冬暂养扣蟹密度越大牛奶病的患病率越高。JUAN P Apún-Molina等人[11]，WU J L等人 [12]也发现高密度的暂养可能是疾病快速传播的原因。 LIU Gang等人表明[13]，高密度培养的南美白对虾对哈维氏弧菌的抗性力显著下降。 同样LIN Yongchin等人（2015年）[14]结果表明，在高密度下养殖的虾中溶藻弧菌的生化活性和清除效率显著降低。阎俭等[15]针对扣蟹的越冬与管理进行论述，扣蟹越冬的密度，应根据越冬池的条件而定。如果池塘底质较好，补水方便，可亩放 450kg～500kg，有经验储户可增加到800kg。而该研究回访了解到盘锦越冬池塘的扣蟹密度为250kg/亩～1250kg/亩，高密度的扣蟹越冬暂养也是导致牛奶病患病率高的重要原因。过高的密度会增加水产动物的对空间和食物竞争，导致生长缓慢，存活率降低[16]，水质恶化，细菌滋生[17]。此外，高密度养殖还会引起水产动物拥挤胁迫，导致免疫应激和氧化损伤[18]。我们之前未发表的研究发现，同类相食会导致健康螃蟹感染。因此，我们提出在高密度培养下，河蟹会通过自相残杀，同类相食和其他接触增加了感染风险造成交叉感染。因此，越冬期间避免扣蟹之间的感染传播是至关重要的。

由于雌蟹价格高于雄蟹，为了提高冬季暂养的效益，大部分扣蟹越冬农户在越冬前会进行雌雄挑选，选擇雌蟹越冬暂养。该研究表明，经过挑选后的扣蟹患牛奶病率（37.2%）高于未挑选的扣蟹牛奶病率（14.7%），可能是由于挑选环节对扣蟹损伤危害，引起了应激反应，造成扣蟹免疫力降低与交叉感染。Vermeersch等[19] 研究表明，经过捕获、分拣和运输过程中对褐虾的翻滚、堆叠会导致虾的重要器官损伤或丢失，并出现很高的死亡率（32.8%～69.8%）。因此，在越冬存储扣蟹前应减少挑选雌雄环节，减轻河蟹的应激反应，降低因挑选导致的扣蟹应激创伤增加的感染牛奶病情况。

4 改进越冬模式的建议

选择越冬暂养的扣蟹在秋季起捕前一个月开始强化营养，投喂玉米、高粱、杂鱼等，以增加扣蟹体内的脂肪积累，使扣蟹体内存储足够的能量，提升免疫力。扣蟹在入越冬池前要彻底清塘，避免混有养殖生物的天敌和残留的致病菌危害扣蟹安全越冬。选择暂养扣蟹前应该进行牛奶病检测抽检，选择病原较少的扣蟹进行越冬，尽量不要对扣蟹进行雌雄筛选，降低因挑选引起的扣蟹“牛奶病”的交叉感染。越冬暂养应控制密度，越冬密度建议不超过750kg/亩。

参考文献：

[1]赖永铅.中华绒螯蟹池塘养殖技术[J].福建农业，2012（10）：30．

[2]农业农村部渔业渔政管理局，全国水产技术推广总站，中国水产学会.中国渔业统计年鉴2020[G].北京：中国农业出版社，2020.

[3]SUN Na，BAO Jie，LIANG Fang，et al.Prevalence of ‘milky disease’caused by metschnikowia bicuspidata in eriocheir sinensis in panjin city， china[J].Aquac Res，2021，53（3）：1136-1140.

[4]马红丽，孙娜，陆晓岑，等.辽宁地区中华绒螯蟹“牛奶病”的病原分离与鉴定[J].大连海洋大学学报，2020，35（5）：714-718.

[5]BAO Jie，JIANG Hongbo，SHEN Hongbin，et al.First description of milky disease in the chinese mitten crab eriocheir sinensis caused by the yeast metschnikowia bicuspidata[J].Aquaculture，2021，532（prepublish）：735984.

[6]JIANG Hongbo，BAO Jie，XING Yuenan，et al.Proteomic analysis of the hemolymph after metschnikowia bicuspidata infection in the chinese mitten crab eriocheir sinensis[J].Frontiers in Immunology，2021，12：659723-659723.

[7]ZHANG Hongqian，CHI Zhe，LIU Guanglei，et al.Metschnikowia bicuspidate associated with a milky disease in eriocheir sinensis and its effective treatment by massoia lactone[J].Microbiol Res，2020，242（prepublish）：126641.

[8]朱必陆，鄢治军.扣蟹越冬培育技术[J].科学养鱼，2011（12）：78.

[9]LU C C， TANG K F J，CHEN S N. Identification and genetic characterization of yeasts isolated from freshwater prawns， Macrobrachium rosenbergii de man， Taiwan[J]. Journal of Fish Diseases， 1998，21（3）：185-192.

[10]CHEN S C，CHEN Y C，KWANG J，et al.Metschnikowia bicuspidata dominates in taiwanese cold-weather yeast infections of macrobrachium rosenbergii[J].Diseases of aquatic organisms，2007，75（3）：191-199.

[11]Juan P. Apún-Molina，Arlett Robles-Romo，Pindaro Alvarez-Ruiz，et al.Influence of stocking density and exposure to white spot syndrome virus in biological performance， metabolic， immune， and bioenergetics response of whiteleg shrimp litopenaeus vannamei[J].Aquaculture，2017，479：528-537.

[12]WU J L，NAMIKOSHI A，NISHIZAWA T，et al.Effects of shrimp density on transmission of penaeid acute viremia in penaeus japonicus by cannibalism and the waterborne route.[J].Diseases of aquatic organisms，2001，47（2）：129-35.

[13]LIU Gang，ZHU Songming，LIU Dezhao，et al.Effects of stocking density of the white shrimp litopenaeus vannamei（boone） on immunities， antioxidant status， and resistance against vibrio harveyi in a biofloc system[J].Fish and Shellfish Immunology，2017，67：19-26.

[14]LIN Yongchin，CHEN Jiannchen，CHEN Yuyuan，et al.Crowding of white shrimp litopenaeus vananmei depresses their immunity to and resistance against vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus[J].Fish Shellfish Immunol，2015，45（1）：104-111.

[15]閻俭.扣蟹的越冬与管理[J].黑龙江科技信息，2012（22）：198.

[16]WYBAN J A，LEE C S，SATO V T，et al.Effect of stocking density on shrimp growth rates in manure-fertilized ponds[J].Aquaculture，1987，61（1）：23-32.

[17]THAKUR P D，LIN K C.Water quality and nutrient budget in closed shrimp（penaeus monodon） culture systems[J].Aquacultural Engineering，2003，27（3）：159-176.

[18]张宝媛.稻蟹共生模式下中华绒螯蟹生长、营养品质及消化生理的研究[D].长春：吉林农业大学，2022.

[19]VERMEERSCH Xavier H C，CHIERS Koen， DECOSTERE Annemie，et al.Evaluation of the effects of onboard sorting and experimental holding practices on the post-catch survival of brown shrimp（crangon crangon l）[J].Marine Biology Research，2018，14（7）：717-727.

A survey on the characteristics of ‘milk disease’ in Eriocheir sinensis farming and overwintering in Panjin region

LIU Fang， LIU Naigeng， YANG Zhanquan， LIANG Fang， XING Dongfei， LI Rang， GENG Dan， SUN Na

（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）

Abstract：In recent years， the outbreak of  “milk disease”  in Eriocheir sinensis in Panjin， Liaoning Province， has caused large economic losses to farmers. In order to investigate the characteristics and pattern of “milk disease”， the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in July-September 2022 on the paddy culture process of Eriocheir sinensis in Panjin area， and the monitoring and investigation of "milk disease" was carried out in December 2022 and February 2023 on different snap crabs with different overwintering densities and different overwintering modes. In December 2022 and February 2023， we investigated the incidence of “milk disease” in snap crabs with different overwintering densities and different overwintering patterns. The results showed that September was the main time for the onset of the disease in the paddy field culture stage， and the incidence rate was higher in the adult crab culture stage than in the snap Eriocheir sinensis culture stage， and the higher the stocking density of snap crabs during the over-wintering period， the higher the prevalence of "milk disease". The prevalence of "milk sickness" increased with higher density during the over-wintering of button crabs. This study provides data support for the prevention and control of milk sickness during Eriocheir sinensis culture and overwintering.

Keywords：Eriocheir sinensis; juvenile crab culture; adult crab culture; juvenile crab overwintering; Metschnikowia bicuspidate

文章编号：1674-2419（2023）06-0409-07

基金项目：辽宁省科学技术基金項目（编号：2022-PJLH-01）；2021年辽宁省“揭榜挂帅”科技攻关项目（2021JH1/10400040）。

作者简介：刘芳（1993.5-），女，辽宁盘锦人，盘锦光合蟹业有限公司研发中心工程师。主要从事水产养殖中水质调控工作。E-mail：910288277@qq.com。

通讯作者：孙娜（1983.9-），女，山东滨州人，盘锦光合蟹业有限公司研发中心主任、高级工程师。主要从事水产苗种育苗中的水质与藻类调控工作。E-mail：sunna0911@163.com。