高产蛋白酶菌的分离、诱变及其对羽毛的降解效果

廖静如，梁琦欣，成洁如，彭芯怡，温倩怡，李威娜，李姣清

（嘉应学院 生命科学学院，广东 梅州 514015）

随着现代人们对家禽消费需求量的持续增加，家禽加工后的副产品羽毛也在大量被积累，目前仅有少量优质的羽毛被用来制造服装、工艺品等，大多数羽毛都被废弃，而羽毛成分中主要成分角蛋白在自然环境条件下难降解，易造成环境污染[1].目前角蛋白降解主要途径包括高温、高压和酸碱水解等，这些途径能耗大，成本高，易对环境造成二次污染，而利用产蛋白酶的微生物对富含角蛋白的羽毛废弃物进行降解则是一种效率高、成本低和环境友好型的方式[2-3].目前已有报道分离出多种能分泌角蛋白酶或是能降解鸡羽毛的菌株，包括真菌、细菌和放线菌[4-6]，然而自然存在的微生物蛋白酶产率往往较低，为解决这一问题，一般要设法获得高产蛋白酶的菌株.紫外诱变是通过紫外线引起菌株基团碱基发生颠换、转换、缺失以及移码突变等达到改变菌株遗传信息的目的[7],经紫外线诱变后通过一定的方法可以筛选出有利或者人们想要的有意义突变，从而获得具有应用价值的菌株.紫外诱变可以提高细菌菌种的产酶能力，如谢凤行等人报道淀粉芽孢杆菌进行紫外诱变后，菌株的产淀粉酶活性由37.10 U/mL 提高到56.95 U/mL，提高了53.5%[8];牛春华等利用紫外诱变的方法成功将枯草芽孢杆菌正变菌株透明圈直径与菌落直径的比值由原来的3.01 提高到5.52[9].因此本试验选择了从鸡羽毛长期堆放的土壤中分离具有降解羽毛能力的菌株为起始菌株，通过紫外诱变，以期提高菌株的蛋白酶活性，筛选出降解羽毛效率更高的突变菌株，为实现羽毛废弃物的资源再利用提供参考途径.

1 实验材料

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集

采自梅州市丙村镇鸡养殖场长期存放废弃羽毛处的土壤，取羽毛堆积处5 cm 的土壤，室内风干后4 ℃储存，备用.

鸡羽毛：收集于梅州市东厢市场鸡屠宰店.将收集的鸡羽毛用自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗，清洗干净后，剪去羽毛梗头部，于烘箱中60 ℃烘干至恒重，保存备用.

1.1.2 培养基

筛选培养基：脱脂奶粉10 g，琼脂15g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O(100 g/L)0.1 mL，NaCl 0.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4，分别经脱脂奶粉与除脂溶解灭菌备用.

复选培养基：完整的整片羽毛2 g，K2HPO41 g,KH2PO40.4 g,NaCl 1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L,pH 7.2～7.4，灭菌备用.

LB 液体培养基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 1 g,蒸馏水1 L,pH 7.2～7.4.

LB 固体培养基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 1 g,琼脂15g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4.

羽毛发酵培养基：称取烘干后完整的鸡羽毛10 g，K2HPO41 g，KH2PO40.4 g，NaCl 1 g，pH 7.2～7.4.

2 实验方法

2.1 菌株分离、筛选及观察

称取5 g 从丙村鸡养殖厂采集的土壤样本，加入锥形瓶内（瓶内含45 mL 无菌水），置于30 ℃、180 r/min 培养摇床30 min，制成悬浮液.取0.1 mL 置于筛选培养基中，于30 ℃、180 r/min 的摇床中培养24 h.取悬浮液按10-4～10-8梯度进行稀释.取各梯度悬浮液0.1 mL 于筛选培养基上涂布，将平板放入37 ℃恒温中培养箱培养48 h，观察其是否长出透明圈并测定透明圈大小，初步筛选蛋白酶活性相对较高的菌株并在复筛培养基上进一步纯化培养后取单菌落进行革兰氏染色，观察菌体形状及大小.

2.2 菌株蛋白酶活性的测定

将筛选TR5 菌株分别接入装液量为50 mL 的发酵培养基，在37 ℃，180 r/min 摇床培养24 h.本试验使用酪蛋白作为底物参照文献来测定菌株的蛋白酶活力[10].蛋白酶酶活力定义：1 mL 液体酶在40 ℃、pH=7.5 条件下每min 水解底物产生1 μg 酪氨酸为一个酶活力单位,以U/mL 表示.蛋白酶活性计算公式如下：

X：样品的酶活力，U/mL；C：样品管的酪氨酸浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；C0：样品空白管的酪氨酸浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V：试样第一次稀释的总体积，单位为毫升（mL）；4：酶反应体系总体积，单位为毫升（mL）；N：样品提取液第二次稀释的倍数；1.0：参与反应的酶量，单位为毫升（mL）；m：试样体积，单位为毫升（mL）；10：反应时间，单位为分钟（min）.

2.3 菌株羽毛降解率的测定

将菌株接种到羽毛发酵培养基中，在37 ℃，180 r/min 摇床培养24 h.将发酵菌液在8 000 r/min 条件下离心10 min，去上清液，吸取少量羽毛发酵培养基吹打离心管中的沉淀物，使其分散，然后转接到50 mL羽毛发酵培养基中，在37 ℃，180 r/min 条件下，连续摇床培养7 d，进行羽毛降解率的测定，分别记录初始羽毛的质量，培养后通过离心取残渣，用烘箱烘至恒重，记录降解后残留羽毛的质量，两者的质量之差就是降解部分的质量：

2.4 菌株DNA 的提取及鉴定

将TR5 菌株接种于50 mL 的LB 液体培养基中，37 ℃培养24 h，按照Omega Bio-Tek 公司生产的试剂盒Bacterial DNA Kit 提取DNA.将样本送至广州艾基生物科技有限公司进行16S rDNA 测序，测序完毕后，将该DNA 序列在NCBI 网站中进行Blast 序列比对，以确定TR5 菌株的类别.

2.5 菌株的诱变

诱变条件：紫外线波长为254 nm，紫外灯功率15 W，照射距离为30 cm，照射时间分别为0 s、60 s、120 s、180 s 和240 s，照射时打开磁力搅拌器，使菌液均匀旋转.然后将诱变菌液进行10 倍稀释，取稀释液0.2 mL 涂布于筛选平板，并用黑色袋子包裹后置于37 ℃恒温培养24 h.挑选菌落周围酶解圈较大的菌株，于发酵培养基中37 ℃恒温培养48 h，检测蛋白酶活性.

3 实验结果

3.1 土壤中产蛋白酶菌株初筛和复筛

从不同土壤中，利用牛奶培养基筛选得到TR1、TR2、TR3、TR4、TR5，5 株能够产蛋白酶的菌株，它们均能有效的分解牛奶培养基中的蛋白成分形成水解圈.通过计算水解圈直径与菌株直径的比值（HC）如表1 所示，TR5 菌株的HC 值最大，初步判断其水解蛋白能力最强.利用羽毛液体发酵培养基，将初筛得到的5 株有较大水解圈的菌株于发酵培养基中进行摇瓶复筛，48 h 发酵后，观察基羽毛降解情况，并以2.2 的方法测定其蛋白酶活力，结果见图1.发现其中编号为TR5 的菌株降解羽毛的效果最好，其酶活力为31.33 U/mL，将菌株TR5 作为出发菌株.

图1 菌株的蛋白酶活力

表1 牛奶培养基菌落的HC 值

3.2 形态学观察及菌株的鉴定

通过筛选获得的菌株TR5，其在初筛平板上菌落为乳白色、边缘不规则、扁平、表面光滑，挑起时较粘稠，革兰氏染色后镜检，发现菌株TR5 为革兰氏阳性菌、短直杆状、有芽孢，染色均匀（图2），初步判断其为芽孢杆菌（Bacillus sp.）.菌株TR5 经16 s rDNA 通用引物进行PCR 扩增，产物测序结果与GenBank 数据库中的序列进行相似性比对发现（图3），该菌株基因序列与芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA 同源性均达98%以上，基本可以确定该菌为解淀粉芽孢杆菌.

图2 TR5 菌株的菌落形态和菌体形态特征

图3 菌种基因结果比对图

3.3 菌株的紫外诱变及突变菌株的筛选

通过紫外照射时间的优化，发现紫外照射120 s 时诱变效果最佳.由图4 可知，诱变后突变株（TR5-1）的酶解圈直径明显比出发菌株(TR5) 大.诱变菌株酶解圈直径与菌落直径的比值也明显大于出发菌株，经过菌株发酵液中蛋白酶酶活的测定，芽孢杆菌TR5 和诱变菌株TR5-1 的酶活力分别为31.33 U/mL，42.13 U/mL，酶活性显著提高.

图4 紫外诱变后不同时间段的水解透明圈

3.4 菌株对羽毛的降解效果

将TR5 和TR5-1 菌株分别接种到含鸡羽毛的发酵培养基中连续培养7 d，试验结果显示诱变菌株TR5-1 在羽毛发酵培养基中对羽毛的降解效果更好，在培养7 d 降解率可高达80.6%，而出发菌株降解率为51.3%，菌株经紫外诱变处理后对羽毛的降解效率显著提高（P＜0.005，见图5）.

图5 菌株对羽毛的降解

4 讨论与结论

鸡羽毛质量占到鸡总质量的5%～7%，己成为家禽屠宰中的主要废弃物，羽毛的不合理处理会造成严重的环境污染[11]，目前利用生物降解方法来降解羽毛是最环保的处理方式，羽毛中90%是角蛋白，故角蛋白酶是生物降解羽毛的关键酶，细菌是角蛋白酶的主要来源，以往人们在自然环境中发现的角蛋白降解细菌以芽孢杆菌为最多，常见的有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，少见的还有专性嗜碱芽孢杆菌[12-13]，这些研究结果表明，自然环境中丰富的芽孢杆菌可能是降解环境中角蛋白废弃物的主力军.本研究通过从环境中分离和鉴定微生物菌株，从而获得了一株能降解羽毛的解淀粉芽孢杆菌，菌能产生蛋白酶降解角蛋白的研究已有报道，王晶等人于2006 年首次从环境中筛选和鉴定一株降解角蛋白降解淀粉芽孢杆菌[14].本研究筛选的解淀粉芽孢杆菌在液体发酵培养时，蛋白酶活性为31.33 U/mL，菌株在羽毛发酵培养基中对羽毛降解率可达51.3 %.为了进一步提高细菌分泌酶的能力，本试验中利用紫外诱变方法使该菌株DNA 中的嘧啶碱基形成二聚体，阻碍碱基的配对，从而影响菌株DNA 正常的复制和转录，引起细菌突变，选育出产酶活性高的突变菌株TR5—1，通过对该菌株羽毛降解能力的研究，发现本研究诱变选育的菌株羽毛降解能力有显著提高，可将该菌株应用于堆肥、禽类羽毛等生物质资源开发利用的前处理阶段；在改善生物废弃物资源堆积、过剩问题，在提高资源转化再利用方面具有广阔的应用前景.