基于巨噬细胞极化探讨化浊解毒颗粒对大鼠急性肺损伤的影响

高芳芳,董 琛,张欢欢,武 蕾,郭 洁,刘小发,贾 琳

(1. 河北中医药大学研究生学院,河北 石家庄 050020;2. 河北省中医院,河北 石家庄 050013)

急性肺损伤是由多种原因导致的肺泡及毛细血管通透性增加,随后引起肺泡及间质水肿,从而出现低氧性呼吸功能障碍的临床常见的呼吸系统危重症,病情严重者发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。急性肺损伤具有起病急、进展快、病死率高等特点[1-2],可严重降低患者生活质量,是现代医学研究的热点问题之一[3]。目前普遍认为炎症贯穿了急性肺损伤/ARDS的整个发病过程,是急性肺损伤/ARDS中最为关键的机制。而巨噬细胞作为炎症反应的重要效应细胞,其极化比例失衡推动了肺部炎症的启动和放大,是导致急性肺损伤/ARDS病情加剧的重要原因之一[4]。抑制巨噬细胞向促炎M1型极化,促进其向抗炎M2型极化,是急性肺损伤/ARDS治疗的重要策略之一[5]。中医药治疗急性肺损伤/ARDS具有多靶点、双向调节等优势,在其较为复杂的发病机制中可发挥多方面调节作用。本课题组在国医大师李佃贵教授浊毒理论指导下,发现“热毒”“湿浊”是急性肺损伤/ARDS的核心病理要素,并依此拟定化浊解毒颗粒。本实验以巨噬细胞极化作为切入点,探讨了化浊解毒颗粒对急性肺损伤大鼠是否具有保护作用,旨在为中医药治疗急性肺损伤提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠 60只,体重(200±20)g,购于湖北省实验动物研究中心,质量合格证号:SYXK(鄂)2022-0065。将大鼠分笼饲养,昼夜各半循环照明,室温(23±2)℃,湿度恒定,自由饮水、摄食。本实验经由河北中医药大学动物实验伦理委员会审查批准(DWLL202203091)。

1.2实验药物与试剂 化浊解毒颗粒(由藿香、黄芩、佩兰、苍术、厚朴、薏苡仁、马鞭草、半夏、茯苓、麻黄、苦杏仁、甘草等组成,为中药配方颗粒剂,由河北省中医院药学部统一采购自广东一方制药有限公司),醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司,国药准字H33021207),脂多糖(北京市索莱宝科技有限公司,批号:L8880),苏木精(Sigma公司,批号:H9627),伊红Y、无水乙醇、二甲苯、盐酸、包埋石蜡、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司,批号分别为71014544,10009218,10023418,10011018,69019361,10004160),大鼠脏器组织单核细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司,批号:TBD2011RATP),CD86+(联科生物公司,批号:AR08604),CD206+(proteintech公司,批号:18704-1-AP)。

1.3仪器 HI650型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),RM2016轮转式切片机(德国Leica公司),JK-6生物组织摊烤片机(武汉俊杰电子有限公司),BX53型生物显微镜(日本Olympus公司),JT-12J电脑生物组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司),JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司),MF52-N型倒置显微镜(Mshot公司),L3-5K型低速离心机(湖南可成仪器设备有限公司),CytoFLEX型流式细胞仪(BECKMAN公司)。

1.4实验方法 大鼠适应性喂养7 d后,以随机数字表法分为空白对照组、模型组、泼尼松组、化浊解毒低剂量组、化浊解毒中剂量组、化浊解毒高剂量组,每组10只。化浊解毒低、中、高剂量组分别给予14 g/kg、28 g/kg、56 g/kg的化浊解毒配方颗粒悬液灌胃(根据大鼠与人给药剂量比值6.25∶1计算,以成人60 kg体重等倍剂量换算为化浊解毒低剂量,化浊解毒中、高剂量分别相当于低剂量的2倍、4倍),泼尼松组给予3 mg/kg醋酸泼尼松稀释液灌胃,空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水,均1次/d,连续7 d。末次灌胃24 h后,除空白对照组外,其余各组参照文献[6]方法构建急性肺损伤模型:将大鼠麻醉后固定在手术板上,沿颈部正中线切开暴露气管,以注射器向气管内滴注脂多糖2 mg/kg,其后将大鼠直立、垂直旋转(使药物在肺部布散均匀),缝合伤口,待大鼠自然苏醒。造模3 h后处死大鼠,取材。

1.5检测指标及方法

1.5.1肺组织病理学形态 采用4%多聚甲醛固定大鼠右肺前叶组织,常规石蜡脱水,二甲苯中透明, 石蜡切片(5 μm),脱蜡,乙醇梯度复水,按照HE染色步骤对肺组织进行HE染色,风干后中性树胶封片,光镜下观察肺组织病理形态。

1.5.2支气管肺泡灌洗液中CD86+M1型和CD206+M2型肺泡巨噬细胞比例 取支气管肺泡灌洗液,4 ℃下1 000 r/min离心10 min,用样本稀释液重悬组织细胞,并将细胞悬液加于分离液(分离液1和2,体积比为3∶1,试剂总量与细胞悬液体积比为2∶1)液面上,离心25 min,取第二层(即环状乳白色单核细胞层),加入5 mL洗涤液,离心10 min,弃上清,重悬细胞,离心10 min,重复2次,再次重悬细胞并计数,加入CD86+,4℃避光孵育30min,1 500 r/min离心5 min,加入工作液,4 ℃避光孵育50 min,1 500 r/min离心3 min,重悬,加入CD206+,4℃避光孵育30min,加入工作液,1500r/min离心3 min,重悬,加入荧光二抗,4 ℃避光孵育30 min,加入工作液,1 500 r/min离心3 min,取得重悬细胞,流式细胞仪检测。

1.5.3肺组织中CD86+M1型和CD206+M2型肺间质巨噬细胞比例 将大鼠右肺后叶组织剪碎,加入1.75×105IU/L胶原酶IA 20 mL,37 ℃消化60 min,将肺组织悬液过滤、离心、洗涤、重悬细胞,计数,加入CD86+,4℃避光孵育30min,1500r/min离心5 min,加入工作液,4 ℃避光孵育50 min,1 500 r/min离心3 min,重悬细胞,加入CD206+,4 ℃避光孵育30 min,加入工作液,1 500 r/min离心3 min,重悬,加入荧光二抗,4℃避光孵育30min,加入工作液,1 500 r/min离心3 min,取得重悬细胞,流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织病理形态 空白对照组大鼠肺组织结构完整,肺泡与肺间质无炎性细胞与红细胞浸润,无充血水肿;模型组大鼠肺组织结构破坏明显,肺泡间隔明显增宽,可见大量炎性细胞浸润和大量红细胞漏出,肺泡腔和间质水肿明显;与模型组相比,各药物组大鼠肺组织破坏程度减轻,肺泡间隔明显变薄,炎性细胞与红细胞浸润程度减轻,间质充血水肿不同程度得到改善,其中化浊解毒高剂量组和泼尼松组改善更为明显。见图1。

图1 空白对照组和急性肺损伤各组大鼠肺组织病理形态(HE染色,×200)

2.2各组大鼠支气管肺泡灌洗液中CD86+M1型和CD206+M2型肺泡巨噬细胞百分比比较 与空白对照组比较,模型组中CD86+M1型肺泡巨噬细胞百分比显著升高(P<0.05),CD206+M2型肺泡巨噬细胞百分比显著降低(P<0.05);与模型组比较,各药物组CD86+M1型肺泡巨噬细胞百分比均显著降低(P均<0.05),CD206+M2型肺泡巨噬细胞百分比均显著升高(P均<0.05);化浊解毒各组间比较,随给药剂量的增加,CD86+M1型肺泡巨噬细胞百分比逐渐降低,CD206+M2型肺泡巨噬细胞百分比逐渐升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2及表1。

表1 空白对照组和急性肺损伤各组大鼠支气管肺泡灌洗液中CD86+M1型和CD206+M2型肺泡巨噬细胞百分比比较

图2 空白对照组和急性肺损伤各组大鼠肺泡巨噬细胞M1/M2型极化情况

2.3各组大鼠肺组织中CD86+M1型和CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比比较 与空白对照组比较,模型组中CD86+M1型肺间质巨噬细胞百分比显著升高(P<0.05),CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比显著降低(P<0.05);与模型组比较,各药物组CD86+M1型肺间质巨噬细胞百分比均显著降低(P均<0.05),CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比均显著升高(P均<0.05);化浊解毒各组间比较,随给药剂量的增加,CD86+M1型肺间质巨噬细胞百分比逐渐降低,CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比逐渐升高,化浊解毒高剂量组CD86+M1型肺间质巨噬细胞百分比明显低于化浊解毒低、中剂量组(P均<0.05),CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比明显高于化浊解毒低剂量组(P<0.05);化浊解毒低、中剂量组CD86+M1型肺间质巨噬细胞百分比和化浊解毒中、高剂量组CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及表2。

表2 空白对照组和急性肺损伤各组大鼠肺组织中CD86+M1型和CD206+M2型肺间质巨噬细胞百分比比较

图3 空白对照组和急性肺损伤各组大鼠肺间质巨噬细胞M1/M2型极化情况

3 讨 论

急性肺损伤的病因包括严重感染、手术创伤、胰腺炎、大量输血、吸入烟雾或有毒气体等,其中严重感染(肺内或肺外因素导致的脓毒症、重症肺炎等)是最常见的病因之一。针对急性肺损伤的治疗,现代医学以肺保护性通气、俯卧位通气、糖皮质激素等为主[7-9],并配合限制性的液体管理策略,但治疗效果不理想。中医药治疗在改善临床症状、抑制炎症反应、截断病情恶化等多方面具有优势及特色[10-11]。《灵枢·五阅五使》记载“故肺病者,喘息鼻张”,其中所描述症状与急性肺损伤呼吸急促、喘息等相对应,故而现代中医学者们多将其归属为“喘脱”“暴喘”“喘证”等范畴。从现代医学对于急性肺损伤病理生理特点的认识出发,结合中医学浊毒理论,本课题组认为“热毒”是急性肺损伤的发病基础,“湿浊”是其重要病理产物,急性肺损伤早期以热为主,热积而成毒,热毒炽盛,壅塞于肺,致上焦水液代谢障碍,湿浊内生,同时热毒煎灼湿浊之邪,凝而成痰,“热毒”“痰湿浊邪”胶结于肺,致肺宣肃失常,出现喘息、气促等症,并致急性肺损伤进展[12-13]。

化浊解毒颗粒具有清热解毒、化浊化痰兼宣降肺气之功效,组方中藿香、佩兰芳香化浊,黄芩清热燥湿、泻火解毒,苍术、厚朴化湿健脾,薏苡仁解毒渗湿,马鞭草解毒利水,半夏、茯苓渗湿浊,麻黄、苦杏仁宣肺降气,甘草解毒并调和诸药。现代药理研究表明,藿香、佩兰有效成分可通过维持促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡而发挥抗炎作用[14-16];黄芩具有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节等作用,其主要活性成分为黄芩素、黄芩苷[17-18];苍术[19-20]、厚朴[21-22]、薏苡仁[23]具有抗炎、抗菌、免疫调节等作用;马鞭草中有效成分马鞭草苷和马鞭草总黄酮可下调炎症因子的表达,进而降低肺泡毛细血管通透性,减轻肺水肿,缓解急性肺损伤[24-25];半夏可镇咳平喘、抗病毒[26],茯苓可抗炎、抗氧化、调节免疫[27];麻黄、杏仁、甘草组成的三拗汤可通过作用于免疫-内分泌-信号传导-细胞过程中的多条代谢通路而发挥抗炎作用[28-29]。在本实验研究中,模型组大鼠肺组织炎性细胞浸润明显,肺组织结构破坏,而化浊解毒各组大鼠肺组织病变明显较模型组轻,说明化浊解毒颗粒可以减轻急性肺损伤大鼠肺部炎症及肺水肿,保护肺组织。

巨噬细胞是参与急性肺损伤发生进展全过程的重要炎性细胞,其不同的极化特征与急性肺损伤的严重程度相关[30]。巨噬细胞如向促炎M1型极化,可导致促炎因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等大量释放,直接损伤血管内皮细胞;并强烈趋化、激活多形核细胞,推动炎症反应升级;直接释放基质金属蛋白酶等,破坏基底膜,扩大炎症反应,引发或加重肺水肿[31-32]。巨噬细胞如向抗炎M2型极化,可通过激活抗炎信号、增加抗炎因子的表达等以减轻炎症反应[33]。此外,肺内巨噬细胞主要包括肺泡巨噬细胞和肺间质巨噬细胞,其中肺泡巨噬细胞约占90%,是其发挥生物活性的主体,且实验获取较为方便,但是单纯观察肺泡巨噬细胞难以完整地反映肺内巨噬细胞状态。相关研究发现,在内毒素血症发生时,肺间质巨噬细胞较肺泡巨噬细胞更早受到内毒素攻击,可更直接地引起肺损伤,是肺组织炎症反应的重要靶细胞[34]。因此,本实验以流式细胞术检测肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞不同极化比例,分析化浊解毒颗粒对急性肺损伤大鼠巨噬细胞极化的影响。结果发现:模型组大鼠CD86+M1型肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞百分比显著升高,CD206+M2型肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞百分比显著降低,说明急性肺损伤大鼠肺巨噬细胞极化状态向促炎M1型转化;与模型组比较,化浊解毒各组大鼠CD86+M1型肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞百分比显著降低,CD206+M2型肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞百分比显著升高,说明化浊解毒颗粒促进了肺巨噬细胞由促炎M1型向抗炎M2型发生转化。

综上所述,化浊解毒颗粒可抑制肺部炎症反应,进而减轻大鼠急性肺损伤,其作用机制可能与调控肺巨噬细胞极化有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。