基于麝香酮对大鼠心肌细胞凋亡的影响探讨辛温通络法治疗糖尿病心肌病的作用机制

魏 芹, 赵晓鹏, 于华林, 燕彩霞

(山东省济南市中西医结合医院, 1. 内分泌, 2. 骨二科, 3. 肝病内科, 4. 肿瘤科, 山东 济南, 271100)

糖尿病心肌病(DCM)是世界范围内心力衰竭的重要原因[1], 其发病机制涉及心脏炎症、氧化应激、心肌纤维化和心肌细胞凋亡等方面[2]。全国老中医药专家陈树泉认为, DCM的基本病机是久病入络,辛温通络为其基础治法。心肌细胞凋亡增加是DCM发生的直接原因之一[3],且越来越多的证据表明糖尿病患者心肌细胞凋亡水平升高,引起心肌细胞减少和心功能不全[4]。因此,抑制心肌细胞凋亡的药物或可作为DCM的潜在治疗药物。麝香酮是人造麝香的主要活性成分,作为辛温通络治疗中的代表性药物,其具有抗脑缺血、抗炎、抗氧化等药理作用[5]。相关研究[6]显示,麝香酮可通过抑制氧化应激和细胞凋亡来缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤,表明麝香酮具有心肌保护作用。另有研究[7]显示,抑制脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配体(FasL)通路可缓解2型糖尿病大鼠心肌损伤。但麝香酮能否通过调控Fas/FasL信号通路而影响DCM大鼠心肌细胞凋亡目前尚不明确。本研究探讨麝香酮对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠(考虑到雌激素对DCM具有保护作用[8], 为了更好地体现药物作用,故仅选用雄性大鼠)72只, 6周龄,体质量210～220 g, 购自浙江维通利华实验动物技术有限公司桐乡分公司,生产许可证号为SCXK(浙)2020-0002。本研究得到济南市中西医结合医院动物伦理委员会审核批准,且所有动物实验遵循3R原则。

1.2 主要试剂

麝香酮购自滁州仕诺达生物科技有限公司; 链脲佐菌素购自上海西唐生物科技有限公司; 二甲双胍购自中美上海施贵宝制药有限公司; 重组人FasL蛋白(rh-FasL)(Fas/FasL通路激活剂)购自湖北艾普蒂生物工程有限公司; Masson染色试剂盒购自无锡云萃生物科技有限公司; 大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司; 兔源一抗裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Fas、FasL、GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.3 DCM大鼠模型构建

采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素方式构建DCM大鼠模型[9], 即用高脂饲料喂养大鼠4周后,禁食12 h, 再一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素, 3 d后若大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L, 表明DCM大鼠模型构建成功。

1.4 动物分组及处理

按照随机数字表法将SD大鼠随机分为空白组、DCM组、麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组、麝香酮高剂量+rh-FasL组,每组12只。除空白组外,其他组均构建DCM大鼠模型,建模成功后进行给药处理, 1次/d给药,持续6周。麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组[10]、二甲双胍组[11]大鼠分别灌胃0.68 mg/kg麝香酮、2.72 mg/kg麝香酮、140 mg/kg二甲双胍,且均腹腔注射等体积生理盐水; 麝香酮高剂量+rh-FasL组[12]大鼠灌胃2.72 mg/kg麝香酮,且腹腔注射0.017 mg/kg rh-FasL; 空白组、DCM组大鼠均灌胃等体积生理盐水,且腹腔注射等体积生理盐水。

1.5 空腹血糖及左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)检测

末次处理结束后,取全部大鼠,禁食、禁水12 h后,先使用动物血糖仪检测大鼠空腹血糖,然后使用彩色多普勒超声显像仪检测LVEF、LVFS。

1.6 标本收集方法

2%戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠,收集大鼠心肌组织,分为2份(每份包含6只大鼠的心肌组织),一份固定于4%多聚甲醛中用于苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色和TUNEL染色,另一份冻存于-80 ℃环境用于氧化应激指标检测和蛋白质印迹法(Western blot)实验。

1.7 HE染色法、Masson染色法检测大鼠心肌组织病理损伤、纤维化程度

将固定于4%多聚甲醛中的心肌组织室温下脱水,包埋在石蜡中,切成5 μm厚切片。对切片进行HE染色或Masson染色,于光学显微镜下观察心肌组织病理变化,通过ImageJ软件计算心肌胶原面积,心肌胶原面积分数(%)=心肌胶原面积/整个视野面积×100%。

1.8 大鼠心肌组织SOD活性及MDA含量检测

严格按照试剂盒说明书检测大鼠心肌组织中SOD活性及MDA含量。

1.9 TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡

取1.7中的切片利用蛋白酶K试剂透化15 min后,加入TdT反应缓冲液37 ℃孵育10 min, 再与TUNEL试剂共同避光孵育30 min, 最后加入DAPI染料对细胞核进行染色,使用荧光显微镜观察细胞染色情况。细胞凋亡率(%)=TUNEL阳性细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。

1.10 Western blot检测大鼠心肌组织中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达

将心肌组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆,并将匀浆在4 ℃条件下以14 000 g离心20 min。蛋白质浓度采用二喹啉甲酸(BCA)法测量。将等量蛋白质经电泳、转膜后,用5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点, 4 ℃条件下与一抗Cleaved-caspase-3(1∶3 000)、Bax (1∶4 000)、Fas(1: 3 000)、FasL(1∶3 000)、GAPDH(1∶4 000)孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤后,将膜与二抗(1∶4 000)孵育2 h。使用电化学发光(ECL)试剂观察蛋白印迹,应用ImageJ软件对蛋白图像进行定量分析。

1.11 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠空腹血糖及LVEF、LVFS比较

与空白组比较, DCM组大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与DCM组比较,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮低剂量组比较,麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮高剂量组比较,麝香酮高剂量+rh-FasL组大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖及心脏功能指标LVEF、LVFS比较

2.2 各组大鼠心肌组织病理损伤及心肌纤维化

HE染色结果显示,空白组大鼠心肌组织结构正常; DCM组大鼠心肌组织中心肌细胞排列紊乱,有大量炎性细胞浸润; 与DCM组比较,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌组织病理损伤减轻; 与麝香酮高剂量组比较,麝香酮高剂量+rh-FasL组大鼠心肌组织病理损伤加重,见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色和Masson染色光学显微镜图像(放大200倍)

Masson染色结果显示, DCM组大鼠心肌胶原面积分数高于空白组,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌胶原面积分数低于DCM组,麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌胶原面积分数低于麝香酮低剂量组,麝香酮高剂量+rh-FasL组大鼠心肌胶原面积分数高于麝香酮高剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图1、表2。

表2 各组大鼠心肌胶原面积分数比较 %

2.3 各组大鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量

与空白组比较, DCM组大鼠心肌组织中SOD活性降低, MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05); 与DCM组比较,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组SOD活性升高, MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮低剂量组比较,麝香酮高剂量组、二甲双胍组SOD活性升高, MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮高剂量组比较,麝香酮高剂量+rh-FasL组SOD活性降低, MDA含量升高,差异有统计学意义(P<0.05), 见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中SOD活性和MDA含量比较

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

DCM组大鼠心肌细胞凋亡率高于空白组,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌细胞凋亡率低于DCM组,麝香酮高剂量组、二甲双胍组大鼠心肌细胞凋亡率低于麝香酮低剂量组,麝香酮高剂量+rh-FasL组大鼠心肌细胞凋亡率高于麝香酮高剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2、表4。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡的TUNEL染色结果(放大200倍)

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较 %

2.5 各组大鼠心肌组织中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白及Fas/FasL通路相关蛋白表达情况比较

表5 各组大鼠心肌组织中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达比较

与空白组比较, DCM组大鼠心肌组织中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05); 与DCM组比较,麝香酮低剂量组、麝香酮高剂量组、二甲双胍组Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮低剂量组比较,麝香酮高剂量组、二甲双胍组Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与麝香酮高剂量组比较,麝香酮高剂量+rh-FasL组Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05), 见图3、表5。

图3 各组大鼠心肌组织中相关蛋白表达的Western blot检测结果

3 讨 论

DCM是心力衰竭和猝死的危险因素[13], 其发病率随着糖尿病患者例数的增加而升高。氧化应激是DCM发病机制中的重要病理生理过程,包含SOD在内的内源性抗氧化剂系统受到高血糖的不利影响,引发进行性氧化应激损伤,改变线粒体膜通透性,导致促凋亡因子释放,进而引起心肌细胞凋亡[14-15]。MDA是由多不饱和脂肪酸氧化产生的不饱和醛,可加重氧化应激反应; SOD是氧化应激的标志物,可发挥抗氧化的作用[16]。本研究通过高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素方式构建DCM大鼠模型后发现,与空白组比较, DCM组大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,心肌组织病理损伤及心肌纤维化严重,提示DCM大鼠模型构建成功。本研究还发现,与空白组比较,DCM组大鼠心肌组织中SOD活性降低,MDA含量、心肌细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表达升高,表明DCM大鼠存在氧化应激及心肌细胞凋亡。

全国老中医药专家陈树泉认为, DCM的基本病机是久病入络,应以“辛温通络”为治疗大法。麝香味辛温,《雷公炮制药性解》提到“麝香为诸香之最,其气透入骨髓,故于经络无所不入”,《得配本草》提到“麝香,通关窍,开经络,透肌骨,安心神”。以麝香为君药的麝香保心丸已被证实对DCM患者心脏功能具有改善作用,还能抑制炎性反应,减轻临床症状。麝香酮是中药麝香的主要成分,具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性[17]。据报道[18-19], 麝香酮通过抗纤维化、抗凋亡来增强心肌梗死小鼠的运动耐力,且可抑制糖尿病周围神经病变过程中雪旺细胞的凋亡。本研究结果显示,麝香酮可抑制DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡,且麝香酮剂量越高,抑制作用越明显。二甲双胍是临床常用的DCM治疗药物[20], 本研究以该药物作为阳性药物,发现高剂量麝香酮与二甲双胍对DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡的抑制作用无显著差异,提示麝香酮能抑制DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡,可能成为治疗DCM的潜在有效药物。

作为一种经典的细胞凋亡调节剂, Fas与FasL结合后,可导致具有死亡结构域的Fas相关蛋白募集到致死信号传导复合物中而引起细胞凋亡[21]。据报道,抑制Fas/FasL通路可减轻大鼠心肌缺血再灌注过程中氧化应激反应造成的心肌损伤[22-23], 激活Fas/FasL通路则可诱导阿霉素处理的大鼠心肌细胞凋亡[24-25]。本研究结果显示,与空白组大鼠比较, DCM大鼠心肌组织中Fas、FasL蛋白表达升高,而经麝香酮干预后, DCM大鼠心肌组织中Fas、FasL蛋白表达降低,故推测麝香酮可能通过抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡。为了验证该推测,本研究在高剂量麝香酮作用的基础上加用Fas/FasL通路激活剂rh-FasL干预DCM大鼠,结果显示, rh-FasL减弱了高剂量麝香酮对DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡的抑制作用,证实麝香酮可能通过抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡。

综上所述,麝香酮可能通过抑制Fas/FasL通路抑制DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡。但麝香酮对DCM大鼠氧化应激及心肌细胞凋亡的抑制作用可能还涉及其他通路,未来还需进一步深入研究加以探讨。