miR-5188 在肝癌细胞中的作用及网络调控机制研究

全养雅 黎慧娟 陈 仕 周 艳

【关键字】 miR-5188；肝细胞癌；DIDO1；NEAT1；pri-miRNA

在亚洲肝细胞癌（HCC）的发病率居恶性肿瘤的第5 位，在中国HCC 也是一种常见的恶性肿瘤[1]。虽然近年来手术切除、射频消融、肝移植等多种治疗方法不断发展，但是HCC 治疗的远期效果仍不理想，经治愈性切除术后患者的5年复发和转移率高达70%，并且多在术后2年内复发[2]。因此，亟需探究HCC 发生和进展的分子机制，从而研发新的诊疗方案，以期改善HCC 患者的预后并提高总体生存率。miRNA 是在真核生物中发现的一类内源性的、长度为20～25 个核苷酸的非编码RNA，能通过与靶mRNA 的互补配对从而在转录后水平调控靶基因表达，导致mRNA 的降解或翻译抑制，进而参与肿瘤的发生和进展过程[3]。研究报道，miR-5188 在HCC 组织中表达上调，乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）可以诱导miR-5188 表达并刺激β-连环蛋白（β-catenin）核转位，从而促进HCC 的肿瘤干性[4]。由于HBV 感染并非是HCC 的充分必要条件，其他因素也可以导致HCC 发生（如丙型肝炎病毒感染等），因此内源性miR-5188 在HCC 发生和进展中的作用仍需进一步探索。本研究探讨了内源性miR-5188 在肝癌细胞中的作用及网络调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验中所用的质粒购自山东维真生物科技有限公司；小干扰RNA（siRNA）、miR-5188 mimics和miR-5188 inhibitor 均由广州瑞博生物医药科技有限公司设计并合成；正常肝细胞LO2 购自北京迈瑞达科技有限公司（货号M186652-125 mL×4）；肝癌细胞HepG2 购自深圳市优里生物科技有限公司（货号BN-CC338070）；DMEM 培养基购自广东环凯微生物科技有限公司（货号XB01-08）；LipofectamineTM2000 转染试剂盒购自北京鼎泰博扬科技有限公司（货号11668027）；MTT 试剂购自深圳市益百顺科技有限公司（货号T818538-5g）；抗NONO 抗体购自广州市文睿科学仪器有限公司（货号DF7254-100）；抗GAPDH 抗体购自广州德为生物科技有限公司（货号AP0066）；抗PSF 抗体购自北京拜尔迪生物技术有限公司（货号bs-19683R）；抗DIDO1 抗体购自广州伟然生物科技有限公司（货号DF3612-100）；G 蛋白 Dyna 珠子购自深圳拓山生物科技有限公司（货号10003D）；潮霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司（货号A600230-0250）；荧光素酶检测试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司（货号11402XY60）；RNA 提取试剂盒购自广州基准科技服务有限公司（货号R4132-03）；反转录试剂盒购自北京泰合通生物科技有限公司（货号4387406）；RIPA 裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司（货号P0013B）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理 LO2 细胞和HepG2 细胞均培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，并置于37 ℃、5% CO2的环境中培养。转染前，将指数生长期的细胞接种于培养板或培养皿中，使用LipofectamineTM2000 转染试剂盒将质粒、siRNA、miR-5188 mimics 和miR-5188 inhibitor 分别转染至细胞，转染后48～72 h 收集细胞，用于后续实验。

1.2.2 细胞增殖能力检测 采用MTT 法检测细胞增殖能力。分别将指数生长期的LO2 细胞和HepG2 细胞接种至培养基中的96 孔板，孵育过夜。使用MTT 试剂（5 mg/mL）检测细胞的增殖能力，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 NONO、DIDO1 和PSF 的表达水平检测 采用蛋白质印迹法检测NONO、DIDO1 和PSF 的表达水平。于裂解缓冲液中获得HepG2 细胞裂解物，使用 BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白质浓度。通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白并转膜，使用相应的抗体（抗GAPDH、NONO、DIDO1 和PSF 抗体）对其进行免疫探测。使用ECL 试剂盒检测蛋白质，使用ChemiDocTMXRS+分子成像仪获取图像。

1.2.4 PSF 与NONO 相互作用的检测 采用免疫共沉淀技术和蛋白质印迹法检测PSF 与NONO 的相互作用。免疫共沉淀的操作步骤：取2 μg 特异性抗体于4 ℃下在 200 μL 裂解缓冲液中与G 蛋白Dyna 珠子偶联2 h，用裂解缓冲液洗涤3 次后，加入300 μL 全细胞提取物（用RIPA 裂解液制备的HepG2 细胞）。将混合物于4 ℃下旋转孵育2 h，将珠子用裂解缓冲液洗涤4 次后，重新悬浮于1×SDS 上样缓冲液中，煮沸用于免疫印迹分析。

1.2.5 miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和长链非编码RNA NEAT1 的表达水平检测 采用实时荧光定量PCR 法检测LO2 细胞和HepG2 细胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和长链非编码RNA NEAT1（下文简称NEAT1）的表达水平。使用RNA 提取试剂盒分离LO2 细胞和HepG2 细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将总RNA合成cDNA，以cDNA 作为模板，使用特异性引物进行扩增。PCR 的反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；然后95 ℃ 15 s，57 ℃ 60 s，共计40 个循环。使用Bio-Rad T100 型和Bio-Rad CFX96 型PCR 仪分别进行cDNA 合成及PCR 反应。

1.2.6 NONO/PSF 与pri-miR-5188 相互作用的检测 采用紫外交联免疫沉淀技术检测NONO/PSF与pri-miR-5188 的相互作用。将15 cm 培养皿中的贴壁细胞在冰冷的PBS 中冲洗2 次，在 254 nm波长的紫外灯（120 mJ/cm2）下交联，在1 mL Tris-HCl 裂解缓冲液中于冰上刮擦并裂解10 min，辅以蛋白酶抑制剂和RNase 抑制剂。将裂解物涡旋，然后在4 ℃下以17 000×g 离心5 min。上清液与5 μg抗NONO 抗体、抗PSF 抗体或对照同种型G 蛋白Dyna 珠子在4 ℃下旋转90 min。用于每个反应的G 蛋白Dyna 珠子（80 μL）用1 mL 裂解缓冲液冲洗2 次，并在4 ℃下用1 mg/mL 的牛血清白蛋白封闭2 h。将珠子重新悬浮于100 μL 裂解缓冲液中，然后添加至反应管中，在4 ℃下旋转孵育2 h。然后用高盐缓冲液将珠子洗涤2 次，并用裂解缓冲液洗涤3 次。免疫沉淀的样品用脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）处理，然后用蛋白酶K 消化。使用RNeasy MinElute 柱试剂盒纯化RNA。

1.2.7 敲除NEAT1 的细胞系构建 构建敲除NEAT1 的HepG2 细胞，以探究NEAT1 在pri-miR-5188 加工中的作用。 使用CRISPR 基因编辑工具（http://crispr.mit.edu） 设计小向导RNA（sgRNA）。将4 对 sgRNA 序列克隆到PiggyBac 质粒（PBC2）中，每对sgRNA 均应用U6 启动子。使用LipofectamineTM2000 转染试剂将含有sgRNA 的PBC2 质粒和表达Cas9 的质粒共转染至HepG2 细胞中。转染后24 h，使用潮霉素处理敲除NEAT1的细胞4 d。活细胞培养于含有10%胎牛血清且不含抗生素的新鲜DMEM 培养基中，以便在分离单个克隆之前恢复1～2 d。采用直接测序法验证敲除成功与否。

1.2.8 miR-5188 与DIDO1 靶向关系的检测 利用miRNA 靶基因预测数据库miRDB 获取miR-5188潜在的靶基因，包括DIDO1、PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 和RPS6KA2 基因。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-5188 与DIDO1 的靶向关系。扩增DIDO1 3'非翻译区（3'-UTR）野生型（WT）片段，用于验证miR-5188 是否靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。应用GeneTailorTM定点诱变系统进行miR-5188 结合位点的定点诱变（MT）。将3'-UTR-WT 或3'-UTRMT 克隆至psiCHECKTM-2 载体中用于荧光素酶检测。将载体与miR-5188 mimics 或对照序列共转染至HepG2 细胞中，并在转染后48 h 应用双荧光素酶报告基因分析系统检测HepG2 细胞中荧光素酶活性。

1.2.9 pri-miR-5188 的加工水平检测 采用双荧光素酶报告基因实验检测pri-miR-5188 的加工水平。构建pri-miR-5188 加工双荧光素酶报告系统，若pri-miR-5188 被加工，则荧光素酶因缺失Poly（A）尾而无法被翻译。将报告载体转染至HepG2细胞中，并在转染后48 h 应用双荧光素酶报告基因分析系统检测经不同处理的HepG2 细胞中荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2 组间比较采用Student'st检验，多组间比较采用单因素方差分析。采用一般线性模型重复测量方差分析比较MTT 测定结果的差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-5188 靶向DIDO1 对HepG2 细胞增殖能力的影响

过表达miR-5188 后，HepG2 细胞的增殖能力增强；敲低miR-5188 表达后，HepG2 细胞的增殖能力减弱，差异均有统计学意义（P均＜0.05）， 见图1。 结果显示， 敲低PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 或RPS6KA2 表达后，HepG2 细胞的增殖能力无显著变化；敲低DIDO1 表达后，HepG2 细胞的增殖能力增强；过表达DIDO1 后，HepG2细胞的增殖能力减弱，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见图2 和图3。过表达miR-5188 后，HepG2 细胞中DIDO1 的表达水平降低；敲低miR-5188 表达后，HepG2 细胞中DIDO1 的表达水平升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见图4。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR（P＜0.05），见图5。同时过表达miR-5188 和DIDO1 后，HepG2 细胞的增殖能力无显著变化，见图6。

图1 过表达或敲低miR-5188 表达对HepG2 细胞增殖能力的影响

图2 敲低DIDO1 表达对HepG2 细胞增殖能力的影响

图3 过表达DIDO1 对HepG2 细胞增殖能力的影响

图4 过表达或敲低miR-5188 表达对HepG2 细胞中DIDO1 表达水平的影响 A 过表达miR-5188 B 敲低miR-5188 表达

图5 miR-5188 与DIDO1 3'-UTR 的靶向关系

图6 过表达miR-5188 或同时过表达miR-5188 和DIDO1 对HepG2 细胞增殖能力的影响

2.2 NEAT1 介导NONO/PSF 复合体形成并促进pri-miR-5188 的加工

与LO2 细胞相比，HepG2 细胞中miR-5188和pre-miR-5188 的表达水平均显著升高，而primiR-5188 的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05），见表1。与LO2 细胞相比，HepG2 细胞中NEAT1 的表达水平显著升高（P＜0.05），而NONO 和PSF 的表达水平差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1 和图7。敲低NEAT1、NONO 或PSF 表达后，HepG2 细胞中pri-miR-5188的表达水平均显著升高（P均＜0.05），荧光素酶活性均显著升高（P均＜0.05），见图8、9。敲除NEAT1 后，HepG2 细胞中pri-miR-5188 的表达水平升高，NONO 与PSF 的相互作用减弱，并且NONO/PSF 与pri-miR-5188 的结合减少，见图10、11 和12。

表1 LO2 和HepG2 细胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188和NEAT1 的表达水平比较

图7 LO2 细胞和HepG2 细胞中NONO 和PSF 表达的蛋白电泳图

图8 敲低NEAT1、NONO 或PSF 表达后对HepG2 细胞中primiR-5188 表达的影响

图9 双荧光素酶报告基因实验检测NEAT1、NONO 或PSF 对pri-miR-5188 的加工水平

图10 敲除NEAT1 后对HepG2 细胞中pri-miR-5188 表达水平的影响

图11 敲除NEAT1 后对HepG2 细胞中PSF 与NONO 相互作用的影响 A 蛋白质印迹法检测亲本细胞和NEAT 敲除细胞中NONO 和PSF 的表达水平 B 免疫共沉淀和蛋白质印迹法检测亲本细胞和NEAT 敲除细胞中NONO 与PSF 的相互作用

图12 敲除NEAT1 后对HepG2 细胞中NONO/PSF 与pri-miR-5188 相互作用的影响

3 讨论

本研究结果显示，过表达miR-5188 可增强HepG2 细胞的增殖能力；而敲低miR-5188 表达后，HepG2 细胞的增殖能力减弱；此外，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。DIDO1 首次在WOL-1细胞中被发现，其氨基酸序列包含1 个富含谷氨酰胺的区域、2 个锌指基序、1 个来自N 端核定位信号的酸性序列，以及1 个位于C 端的富含赖氨酸的序列[5-6]。在正常细胞质中，丝氨酸/苏氨酸上的DIDO1 磷酸化水平较低[7]；若DIDO1 被磷酸化激活后，其会移位至细胞核以触发WOL-1 细胞凋亡[8]。由此推测，miR-5188 可能通过下调DIDO1的表达及降低肝癌细胞的凋亡水平，从而促进肝癌细胞增殖。

本研究结果显示，与LO2 细胞相比，HepG2细胞中miR-5188 和pre-miR-5188 的表达水平均显著升高，而pri-miR-5188 的表达水平显著降低。研究发现，小部分miRNA 是由自身基因编码的，约80%的miRNA 来自各种大型编码和非编码转录物[9]。这些最初的转录本被称为pri-miRNA，可被细胞核中由Drosha 和DGCR8 组成的微处理器复合物加工成pre-miRNA[10]。由Exportin 5 进行核输出后，pre-miRNA 可被Dicer 酶进一步加工为成熟的miRNA，然后进入RNA 诱导的沉默复合物而发挥生物学功能[11-13]。由此推测，提高肝癌细胞中primiR-5188 的加工水平可升高成熟miR-5188 的表达水平。本研究结果显示，敲除NEAT1 后，HepG2 细胞中pri-miR-5188 的表达水平升高，NONO 与PSF的相互作用减弱，并且NONO/PSF 复合体与primiR-5188 的结合减少。研究表明，在转录过程中和转录后，大量RNA 结合蛋白、RNA 解旋酶可在单个加工步骤中调节miRNA 的生物发生[14]。另有研究报道，NEAT1 可以促进NONO/PSF 复合体形成[15]，这与本研究的结论相符。NONO/PSF 复合体可以结合大量表达的pri-miRNA，并提高Drosha-DGCR8微处理器复合物对pri-miRNA 的处理能力[14]。因此，NEAT1 可以介导NONO/PSF 复合体形成并促进pri-miR-5188 的加工。

综上所述，HepG2 细胞中NEAT1 的表达水平升高，提高了NONO/PSF 复合体对pri-miR-5188 的加工水平，增强了miR-5188/DIDO1 轴对HepG2 细胞增殖能力的正向作用。因此，miR-5188 可能可以作为HCC 的潜在治疗靶点。本研究是一项基于体外细胞水平的实验，未进行临床试验或活体动物实验，下一步将构建敲除NEAT 的小鼠模型以验证本研究结论。