簇毛麦染色体特异分子标记的筛选及应用

张 伟

（铜陵市农业技术管理服务中心，安徽 铜陵 244000）

簇毛麦（Haynaldia villosa），又名属小麦族簇毛麦属，是小麦的一个野生近缘种，不但抗小麦白粉病、锈病、全蚀病和眼斑病等多种病害[1-3]，而且具有分蘖力强、抗寒耐旱、密穗多花和籽粒蛋白质含量高等特点[4-5]，是小麦遗传改良的重要基因源。为了进一步转移和利用簇毛麦其他优异基因，以硬粒小麦-簇毛麦双倍体[6-7]为基础材料，利用花粉辐射与有性杂交相结合，创制出大量的小麦-簇毛麦属间染色体易位，用中国春对这些材料连续回交，已得到普通小麦背景中只包含单条簇毛麦染色体结构变异的一些单株。早期准确鉴定这批单株中簇毛麦的身份，对于簇毛麦有益基因的定位及利用，都具有重要的现实意义和应用价值[8-10]。

据统计，目前报道的簇毛麦各类标记仅有43个[11-13]，且分布不均匀，利用这些标记来鉴定大量的簇毛麦染色体结构变异体是远远不够的。随着测序技术的发展，大量涌现的表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）序列为引物设计提供了便利[14-15]。EST 是对cDNA 文库随机挑取的克隆进行大规模测序获得的一段cDNA 的5′或3′端序列，长度一般为300～500 bp[16-18]。比较基因组研究结果表明，EST 的序列组成和染色体上的排列顺序在禾本科物种间具有高度的共线性[19]。小麦及其近缘物种的EST 在理论上具有更高的共线性，定位于小麦染色体某一部分同源群的EST 也应存在于近缘物种同一部分同源群染色体的对应部位。由于EST 来自转录区，其保守性较高，在族和属间的通用性比来源于非表达序列区的标记更好，特别适用于远缘物种间的比较基因组研究，另外，利用EST序列开发的各种标记具有多态性高、操作简单、经济并且高效的特点。本研究为了鉴定花粉辐射得到的结构变异染色体中的簇毛麦身份，基于作物的共线性关系，利用小麦的EST 序列合成STS 引物，以及小麦、大麦和黑麦的SSR 引物，筛选能准确鉴定簇毛麦各条染色体的特异标记，为簇毛麦的进一步研究和利用提供更便捷有效的工具。

1 材料与方法

1.1 实验材料

普通小麦中国春（Triticum aestivumvar.Chinese Spring，CS）、簇毛麦（由南京植物园从英国剑桥植物园引进）、硬粒小麦（T.durum）由中国农业科学院引种组从国际玉米小麦改良中心引进，编号“中引1286”）、硬粒小麦-簇毛麦双倍体（T.durum-H.villosa amphiploid，由南京农业大学细胞遗传研究所选育）、小麦-簇毛麦整套二体异附加系DA1V至DA7V和硬粒小麦-簇毛麦双倍体花粉辐射回交后代均由南京农业大学细胞遗传研究所保存。

1.2 引物

为筛选簇毛麦1V 至7V 各条染色体的特异标记，根据小麦EST 序列合成了1 125 对STS 引物；另选用小麦SSR 引物227 对，大麦SSR 引物61 对和黑麦SSR 引物163 对（表1）。以上引物均由上海英骏生物公司合成。

表1 本研究用于筛选簇毛麦染色体特异标记的引物类型

1.3 基因组DNA提取

参照Sharp 等[20]的方法，用1×TE 溶解，4 ℃保存备用。

1.4 PCR反应

PCR体积为10 μL，包含约20～30 ng模板DNA，1×buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 mmol/L dNTP，引物终浓度各为0.2 mol/L，0.5 UTaqDNA 聚合酶（以上试剂均来自Promega 公司）。PCR 程序为94 ℃变性3 min；94℃30 s、55～60 ℃（依引物而定）50 s、72 ℃1 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。

1.5 产物检测

参照Tixier 等[21]的方法检测产物，其中所用Marker 为DL2000（Promega）。PCR 扩增产物或酶切产物中加入聚丙烯酰胺凝胶电泳专用的Loading buffer 2 μL 混匀，取3 μL 样液用8%聚丙烯酰胺凝胶（39∶1）电泳检测结果。电泳时总电压为180 V，电泳1.5 h 左右，银染后将胶放在凝胶成像仪上观察照相[22]。

2 结果与分析

2.1 筛选簇毛麦各条染色体特异分子标记

在检测的1 125对小麦EST引物中，有597对引物可以在中国春与簇毛麦间扩增出多态性条带，占小麦EST引物的53.1%；在检测的227对小麦SSR引物中，有93对引物可以在中国春与簇毛麦间扩增出多态性条带，占小麦SSR 引物的41.0%；在检测的61 对大麦和163 对黑麦的SSR 引物中，分别有13 对和52 对引物可以在中国春和簇毛麦间扩增出多态性条带，分别占大麦SSR 引物的21.3%和黑麦SSR引物的31.9%。可以看出，利用小麦EST 序列设计的引物和小麦的SSR 引物在亲本间有较高的多态性，而大麦和黑麦的SSR 引物在亲本间的多态性较低。用这些多态性引物对亲本及普通小麦-簇毛麦1V-7V 二体附加系进行扩增分析，筛选到簇毛麦特异条带只出现在1个异附加系中并且带纹稳定清晰的引物共89对，其中，1V标记2个、2V标记14个、3V标记8个、4V标记8个、5V标记41个、6V标记2个和7V标记14个，如表2所示。

表2 所筛选的簇毛麦染色体特异分子标记

位于小麦第一群的SSR引物Xbarc210在簇毛麦、硬粒小麦-簇毛麦双倍体以及1V附加系中均扩增出相同的220 bp，而中国春及其他附加系则无此带（图1a），表明Xbarc210-220可作为簇毛麦1V染色体的特异标记。同样，引物CINAU186、CINAU200、CINAU206、CINAU211、CINAU250和CINAU255在分别涉及簇毛麦2V、3V、4V、5V、6V和7V染色体异附加系中均可扩增出与簇毛麦、硬粒小麦-簇毛麦双倍体相同的特异带，因此可分别作为簇毛麦2V、3V、4V、5V、6V和7V染色体的特异标记（图1b-g）。另外，本研究发现，定位于第五和第七群的EST序列所涉及的引物可以特异追踪簇毛麦的7V和4V染色体，这一结果符合小麦在进化过程中第四、第五和第七群之间发生了复杂的易位和倒位。如根据第五群EST序列设计的引物CINAU259（5AL 0.59-0.78）可以追踪簇毛麦的7V 染色体，而根据第七群EST 序列设计的引物CINAU206 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU207 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU208 （7AS 0.89-1.00，7BS 0.27-1.00） 和CINAU209（7DS 0.61-1.00）可以特异追踪簇毛麦的4V染色体。

图1 引物对亲本及小麦-簇毛麦异附加系DNA的扩增

2.2 簇毛麦染色体结构变异体鉴定

从中国春/硬粒小麦-簇毛麦（60Co-γ 射线照射花粉）//中国春BC3～BC4代中，选用经GISH 鉴定在普通小麦背景中只含单条簇毛麦染色体结构变异的110 份材料，用本研究得到的和已有的146 个簇毛麦特异引物扩增亲本和110 份材料的DNA，鉴定所涉及的簇毛麦染色体身份。图2 是利用定位于簇毛麦1V 染色体短臂标记Xcinau27-620和长臂标记Xcinau32-300在亲本和部分簇毛麦染色体结构变异体单株中的扩增结果。CINAU27 在簇毛麦、硬粒小麦-簇毛麦双倍体、1V 附加系、1VS·W、TV54-4-1（泳道14）、TV288-4（泳道15）、TV277-7（泳道16）和TV281-6（泳道18）中扩增出约620 bp的特异带，而中国春和其他结构变异体均未扩增出此带（图2a）；CINAU32 分别在TV322-22（泳道17）、TV281-6（泳道18）和TV279-2（泳道19）中扩增出与簇毛麦相同的300 bp 的特异带，而中国春和其他变异体均未扩增出此带（图2b），表明这些材料中涉及的外源染色体片段均为1V 染色体片段。

图2 特异引物CINAU27（a）和CINAU32（b）对簇毛麦结构变异染色体系DNA的扩增

3 结论与讨论

对导入小麦背景中簇毛麦染色体的准确鉴定是利用其优异基因的前提，鉴定方法有多种，如形态学标记、C-分带和生化标记等，但这些方法都有各自的局限性。建立在DNA 水平上的分子标记所揭示的多态性直接反映基因组DNA 间的差异，不受发育阶段和环境的影响[12]，因此是鉴定小麦背景中簇毛麦染色体“身份”、易位染色体断点位置和片段长度的有效工具。课题组一直致力于簇毛麦各条染色体特异分子标记的开发，据统计，现开发的基于PCR 的簇毛麦各条染色体特异分子标记共有43 个（表3），分布不均匀，其中3V、5V 和7V 染色体标记较少，只有2～3 个。可见，要想鉴定花粉辐射得到的一大批簇毛麦染色体结构变异体，各类标记的密度远未达到令人满意的程度。本研究针对这一现状，利用EST-STS 通用性好、稳定性高的特点，筛选到84 对分布于1V—7V 染色体的STS 标记，另外还筛选到5 对SSR 标记，对已开发或筛选的簇毛麦分子标记起到有益补充。因已得到的4V和6V染色体标记较多，本研究未对其作针对性筛选。

表3 开发的簇毛麦各条染色体基于PCR的特异分子标记

续表3 开发的簇毛麦各条染色体基于PCR的特异分子标记

续表3 开发的簇毛麦各条染色体基于PCR的特异分子标记