微孔草孢囊线虫孵化和侵染特性

魏雪娟，李文豪，刘永刚，倪春辉，乔万强，安丽婷，李惠霞

（甘肃农业大学植物保护学院, 甘肃 兰州 730070）

微孔草(Microula sikkimensis)属于紫草科微孔草属两年生草本植物，为我国特有的耐高寒优质珍稀野生油料植物[1]，主要生长在青藏高原及毗邻的高寒地区[2]。微孔草具有独特的药用、保健和营养等价值，其茎叶可饲用，其种子富含γ-亚麻酸、α-亚麻酸等天然不饱和脂肪酸，可用于治疗心脑血管疾病，具有防止血脂沉积、预防高脂血症等功能[2-3]。目前，微孔草的研究主要集中在种子营养成分分析、人工种植、资源调查及利用等[4]方面，鲜有关于微孔草病害及抗逆性方面的报道。

孢囊线虫(cyst nematodes)是植物寄生线虫(plantparasitic nematodes，PPN) 的重要类群之一，属于固着型内寄生线虫[5]。其中禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、大豆孢囊线虫(H.glycines)和甜菜孢囊线虫(H.schachtii)引起的孢囊线虫病分别是严重威胁麦类、大豆(Glycine max)和甜菜(Beta vulgaris)的重要病害，造成不同程度的经济损失[6]。在我国，仅大豆孢囊线虫每年造成6 亿元以上的经济损失[7]。微孔草孢囊线虫(H.microulae)为甘肃农业大学植物保护学院植物病原线虫实验室2020 年在甘肃省天祝高寒草甸发现寄生微孔草的孢囊线虫属新种，是我国发现的首个豌豆孢囊线虫的线虫[8]。目前，对于微孔草孢囊线虫生物学特性及其引起的病害均缺乏了解。

孢囊线虫典型的生活史是由孢囊内的卵孵化，破壳孵出线形的二龄幼虫(second-stage juvenile，J2)，J2 从根尖侵入根系，在中柱鞘附近建立取食位点，之后再经2 次蜕皮，依次发育成豆荚形的三龄幼虫(J3)和四龄幼虫(J4)。第4 次蜕皮后，柠檬形的白色雌虫尾部突破根表，线形的雄虫离开根系，进入土壤寻找雌虫受精，受精后的雌虫开始产卵[5]。线虫卵的孵化特性因种类不同而异，也受温度和土壤理化环境的影响。了解其卵的孵化、J2 活性及其生活史，对于掌握微孔草孢囊线虫生物学特性及其侵染规律具有重要意义。因此，本研究以微孔草孢囊线虫为材料，观测不同温度和孵化液对卵孵化及J2 存活能力的影响，并观察其生活史，以期为该线虫生物学研究奠定基础，也为该病害及时有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 线虫的采集及孢囊的分离

供试微孔草孢囊线虫，采自甘肃省天祝高寒草甸牧草微孔草根及根际10 cm范围内的土壤，带回实验室风干后，参照段玉玺[6]的简易漂浮法分离孢囊线虫。将得到的分离物移至0.15 mm 尼龙纱，在体式显微镜(奥林巴斯，东京，日本)下挑选新鲜饱满的孢囊，于4 ℃冷藏备用。

1.2 孵化保湿液制备

1.2.1 微孔草分泌物的制备

参考徐志鹏等[9]的方法并稍有改动。将微孔草种子用5.25%次氯酸钠溶液消毒10 min，用无菌水清洗干净后，放置在垫有滤纸的15 cm 培养皿中保湿催芽。待种子发芽后加入无菌水，10 d 后收集其根系培养液，用漏斗经无菌滤纸过滤后备用。

1.2.2 根系土壤浸液的制备

参考王明祖和颜家坤[10]的方法并稍有改动。将30 g 风干的微孔草根际土壤放置在烧杯内，加无菌水约200 mL，随后搅拌4 min 使土壤充分溶解，静置约30 min，取上清液，用漏斗经无菌滤纸过滤后备用，即为根系土壤浸液。

1.2.3 根汁的收集

参考贺沛成等[11]的方法并稍有改动。将新鲜的微孔草根组织用无菌水洗净，用无菌滤纸吸除多余水分。取约20 g 干净根系置于研钵内小心研碎并榨取汁液，用漏斗经无菌滤纸过滤后得到根汁，再用无菌水稀释5 倍、10 倍和20 倍后备用。

1.3 温度对孢囊内卵孵化的影响

将选取的孢囊消毒后，置于盛有微孔草根系分泌物的6 孔细胞培养板中孵化。设置10、15、18、20、25 和30 ℃ 6 个温度梯度，每个温度处理选10 个孢囊，每处理重复3 次。每隔2 d 查看卵的孵化数量，每4 d 更换1 次孵化液，统计30 d 内的卵孵化总量，并计算孵化率。

1.4 不同孵化液对孢囊内卵孵化的影响

分别选取土壤浸液，微孔草5 倍根汁、10 倍根汁、20 倍根汁，4 mmol·L-1ZnCl2溶液和无菌水6 种孵化液，并在最适温度15 ℃下进行孵化，其他操作同1.3。

1.5 温度对J2 存活能力的影响

1.5.1 初孵J2 存活能力观察

参考贺沛成等[11]的方法，在1.3 试验的第20 天起， 每2 d 统计1 次， 连续统计5 次，分析初孵J2的存活情况。死亡的J2 呈僵直状，体内含有大量的气泡。若无法辨别，则将其挑入2%氯化钠溶液观察，活虫会卷曲，若虫体无生命体征，则按死虫统计。

1.5.2 J2 离体存活能力观察

参考郑经武等[12]的方法，将50 条初孵J2 移入6 孔细胞培养板， 加盖后分别置于4、10、15、20 和25 ℃的培养箱中， 每温度重复3 次， 每2 d 观察一次并剔除死虫。线虫死活鉴定同1.5.1。

1.6 室内生活史观察

先将微孔草种子经5.25%次氯酸钠溶液消毒处理，用无菌水冲洗3 遍[13]，再将种子置于垫滤纸的培养皿内，放入25 ℃恒温光照培养箱中黑暗条件催芽2 d。将经180 ℃处理4 h 的灭菌土装入直径9 cm、高12 cm 的塑料花盆，而后选取催芽后长势基本一致的种子，将其种植在花盆内，每盆定植1 株，共播种30 盆。待微孔草长出2～3 片真叶时，参照甄浩洋等[14]方法，接微孔草孢囊线虫新鲜卵每盆2 000 粒。接种时，用玻璃棒在微孔草根部周围1～2 cm 均匀地打3 个洞，用移液枪将微孔草孢囊线虫新鲜卵悬浮液打进洞中，并用少量的灭菌土壤覆盖。接种后于15 ℃恒温光照培养箱中以14 h/10 h 光暗培养。接种后每3 d 随机取2 株观察，并采用次氯酸钠-酸性品红染色法进行染色[6]，用体式显微镜(奥林巴斯，日本东京)和生物显微镜(蔡司，德国)观察各龄期线虫在根系中的发育情况。同时，记录各龄幼虫、白雌虫及孢囊首次出现的时间。

1.7 数据分析

采用Excel 2016 软件分别对数据进行整理和初步分析，采用单因素方差分析和邓肯法多重比较分析不同温度、不同孵化液、不同时间处理之间的差异，统计水平为0.05，使用SPSS 19.0 进行显著性检验；图表绘制采用Excel 2016。

2 结果

2.1 温度对微孔草孢囊线虫孢囊内卵孵化的影响

15 ℃处理30 d，微孔草孢囊线虫卵的孵化率最高，为32.0%，显著高于其他温度下的孵化率(P＜ 0.05)(图1A)。18 ℃下次之，孵化率为21.7%。而20 和25 ℃下孵化率均低于15%，10 和30 ℃下孵化率均低于5%。因此，15 ℃为该线虫最适宜的孵化温度。

图1 温度、孵化液对微孔草孢囊线虫孵化的影响Figure 1 Effects of temperature and hatching solutions on the hatching of Heterodera microulae

2.2 孵化液对孢囊内卵孵化的影响

在15 ℃下，微孔草孢囊线虫的卵在土壤浸液、20 倍、10 倍微孔草根汁有利于线虫孵化，卵孵化率分别为28.1%、20.0%、15.3%，均显著高于无菌水处理组(P＜ 0.05)，分别为无菌水的2.96 倍、2.11 倍和1.61 倍 (图1B)。4 mmol·L-1ZnCl2溶液中的孵化率与无菌水处理无显著差异(P＞ 0.05)，而5 倍微孔草根汁的孵化率显著低于无菌水。

2.3 温度对初孵J2 存活能力的影响

在15 ℃下30 d 2 龄幼虫的存活率最高，为72.7%，显著高于大于15 ℃处理的存活率(P＜ 0.05)(图2)。10 ℃下次之，存活率为67.2%。当温度为30 ℃时，20 d 时J2 全部死亡。可见，10～15 ℃为初孵J2 适宜的存活温度。

2.4 温度对微孔草孢囊线虫J2 离体存活能力的影响

微孔草孢囊线虫J2 在不同温度下处理18 d 时，除4 ℃外，其他温度下超过半数的线虫死亡(图2)。当处理30 d 时，4 ℃下线虫死亡率最低，为34.7%；15 ℃次之，虽然线虫活动能力较强，但死亡率为95.3%，其他温度下死亡率为100%。由此可见，4 ℃适合较长时间保存该线虫，而15 ℃只适合短期保存。

2.5 室内生活史观察

15 ℃下接种新鲜的卵后，微孔草根系内线虫发育情况如图3 所示。接种后3 d，可在微孔草根系检测到蠕虫形的J2 (图3A)。接种后9～15 d，观察到大量J2 侵入根系，但尚未见J3 (图3B)。接种18 d 后，在根系观察到豆荚形的J3 (图3C，D)。接种24 d后，首次在根系观察到膨大成柠檬形的J4 和雌虫(图3E，F，G，H)。接种27 d 后，根部观察到少量淡褐色孢囊(图3I)。综上所述，在15 ℃下，该孢囊线虫在微孔草根系内良好发育，完成一代最短为27 d。

图3 15 ℃下微孔草孢囊线虫在微孔草中的生活史Figure 3 Life cycle of Heterodera microulae in roots of Microula sikkimensis at 15 ℃

3 讨论与结论

作为一种变温生物，线虫的孵化、生长发育、种群动态与温度密切相关[15]，由于生态型的差异，线虫不同地理群体间的最适孵化温度随之不同[12]，大多数孢囊属线虫卵孵化的适宜温度为15～29 ℃[16]。本研究结果表明微孔草孢囊线虫卵孵化的最适温度为15 ℃，与禾谷孢囊线虫的最佳孵化温度接近[12]，属于低温孵化型线虫。而玉米孢囊线虫(Heterodera zeae)最适孵化为33 ℃[17]、旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)甘肃群体为28 ℃[9]、甜菜孢囊线虫(H.schachtii)为25 ℃、大豆孢囊线虫为24 ℃[17]及Vandenbossche 等[18]报道甜菜孢囊线虫在20～30 ℃累积的孵化率最高，这几种线虫属于高温孵化型线虫。

作为微孔草孢囊线虫主要寄主的微孔草，生长在气候寒冷潮湿、昼夜温差较大的环境。目前，微孔草孢囊线虫在天祝高寒草甸微孔草上发现。天祝县位于河西走廊祁连山东端，海拔2 040～4 874 m。当地气候寒冷潮湿、空气稀薄、昼夜温差大，年均温为-0.1 ℃，仅分冷、热两季[19]。生存在这样的环境下，微孔草孢囊线虫形成了低温孵化的习性。本研究发现，该线虫新鲜孢囊中的卵不需要低温刺激即可孵化，这一点与禾谷孢囊线虫[20]不同。

一般来说，寄主根系分泌物可刺激卵的孵化[21]。本研究结果显示，土壤浸液和20 倍微孔草根汁对微孔草孢囊线虫卵的孵化有促进作用，而5 倍微孔草根汁对孵化有明显的抑制作用，这与根汁对旱稻孢囊线虫孵化(H.elachista)的作用结果一致[9,11]。说明土壤和微孔草分泌物中可能存在诱导孢囊孵化的化学物质，土壤浸液更接近田间土壤生化环境，20 倍微孔草根汁更接近寄主根系分泌物浓度，但对于微孔草根系分泌物种类及其作用机理有待进一步研究。本研究发现4 mmol·L-1ZnCl2溶液对微孔草孢囊线虫孵化无显著促进作用，这与Zn2+对小麦孢囊线虫效果一致[22]。但也有研究表明，Zn2+刺激会促进禾谷孢囊线虫的孵化[23]，说明Zn2+对不同种类孢囊线虫卵孵化的影响不同。

本研究表明，在10～18 ℃时，初孵J2存活率在60%以上，30 ℃下J2 全部死亡，而高温型的旱稻孢囊线虫在30 ℃时存活率为69.3%[11]。这表明低温环境更适宜微孔草孢囊线虫。微孔草孢囊线虫在15 ℃时，离体J2 死亡率低、幼虫较活跃，适宜侵染。而旱稻孢囊线虫甘肃群体、旱稻孢囊线虫湖南群体分别在25 ℃[9]、30 ℃[11]时活动能力较强，有利于侵染作物。

孢囊线虫生活史的长短取决于线虫种类、寄主和环境条的影响，典型的孢囊线虫完成一个生活史约30 d[5]。本研究中，15 ℃下微孔草孢囊线虫完成生活史需27 d。与大豆孢囊线虫20 ℃下需31 d[5]、甜菜孢囊线虫环境适宜时需30 d[24]相比，微孔草孢囊线虫生活史较短，但比旱稻孢囊线虫30 ℃下需22 d[25]、玉米孢囊线虫36 ℃下只需15～18 d[26]生活史略长。研究表明，许多作物孢囊线虫可寄生于多种田间杂草，使其种群密度增大，从而对作物造成更大危害[27]，如禾谷孢囊线虫杂草寄主有禾本科节节麦(Aegilops tauschii)、鬼蜡烛(Phleum paniculatum)[28]、野燕麦(Avena fatura)、黑麦草(Lolium perenne)、鹅观草(Roegneria kanoji)、苇状羊茅(Festuca elatiorvar.arundinucea)、球茎草芦(Phalaris tuberosa)、鸭茅(Dactylis glomerata)[29]和 醉 马 草(Achnatherum inebrians)[30]，及嵩草(Kobresia humilis)等莎草科植物[31]。大豆孢囊线虫杂草寄主有小野芝麻(Galeobdolon chinense)、宝盖草(Lamium amplexicauie)、败酱草(Thlaspi arvense)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)[27]、繁缕(Stellaria media)、虎尾草(Chloris virgata)和毛茛(Ranunculus japonicus)等冬季阔叶性杂草[32]。在甘肃天祝地区，微孔草在农作物大田中生长较普遍，因此，在田间微孔草孢囊线虫是否危害栽培的农作物，还有待进一步调查。