裂解多糖单加氧酶Af LPMO7的酶学特性研究

马 磊，娄淑慧，尹玉莹，安姝宇，朱超强，韩 艺，高建民

（河南城建学院生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036）

我国是农业大国，每年均会产生大量纤维素类农业废弃物，若能将其有效利用，不仅能够减轻生态环境的压力，还能够避免大量的资源浪费。纤维素是一种高分子有机聚合物，由大量单糖组成。为了有效利用纤维素，需要将其水解成为寡糖或单糖。目前，常使用糖苷水解酶催化降解纤维素［1］，但由于糖苷水解酶对纤维素结晶区的利用效率较低，需通过物理或化学方法对纤维素进行预处理［2］，以便提高糖苷水解酶对纤维素的降解效率。近年来，学者发现了裂解多糖单加氧酶（LPMO），将其归类于辅酶家族［3］（AA家族），其能有效降低多糖底物的结晶度，且能有效提高糖苷水解酶的水解效率。关于AA家族，目前研究最多的是AA9家族［4］，其主要作用于纤维素底物。进一步研究AA9家族，将对高效水解纤维素提供一定的技术支持。

木质纤维素是重要的可再生资源，酶解法是将其降解利用的重要途径。对AfLPMO7蛋白的深入研究，提高其降解效率，阐明其在生物质降解中的作用，更好地促进农业废弃物的降解，进而创造较高的经济价值，对我国农业废弃物的资源化利用具有重要的意义。本研究围绕AfLPMO7蛋白进行蛋白表达与纯化、底物吸附、酶活力测定、氧化能力分析与底物识别等。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：大肠杆菌BL21，由平顶山市珍稀食用菌工程技术研究中心保存。

质粒：含有Tev标签的pCold TF载体，由平顶山市珍稀食用菌工程技术研究中心保存。

商业酶：纤维素酶（cellulase）来源于Aspergillus niger。

LB培养基：蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母粉5 g。

试剂：（1）平衡液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，10 mmol iminazole，NaOH调节pH至8.0，用0.22μmol滤膜抽滤后使用。（2）洗脱液。50 mmol NaH2PO4，300 mmol NaCl，300 mmol iminazole，NaOH调节pH至8.0，用0.22μmol滤膜抽滤后使用。（3）30%Acr－Bis（29∶1）、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液、10%过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、蛋白5×loading、预染蛋白Marker、Xylan、2，6－DMP等均购自源叶生物公司。（4）3%H2O2购自平顶山新城区药店。（5）考马斯亮蓝染色液。0.25 g考马斯亮蓝R－250溶解于包含40%甲醇的水溶液中。（6）脱色液。10%乙酸、5%乙酸溶解于去离子水中。（7）结晶纤维素（Avicel PH101）购自Sigma公司；没食子酸和氯化铜均购自南试公司。

供试仪器：AKTA蛋白纯化仪（美国通用GE／AKTA Pufier10）。

1.2 方法

1.2.1AfLPMO7的进化树分析

选取与AfLPMO7关系相近的22个蛋白的氨基酸序列，将其保存为fasta格式，使用MEGA（version 5.1，Mega Limited，Auckland，New Zealand）绘制进化树。

1.2.2AfLPMO7的功能预测

将AfLPMO7的氨基酸序列录入在线数据库Conserved Domain Database（CDD）（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）上，对其功能模块进行预测。

1.2.3AfLPMO7的表达和纯化

将AfLPMO7的基因序列连接至含有Tev标签的pCold TF载体上，通过42℃热击转化方式将其导入大肠杆菌BL21中，得到转化子，将转化子接入LB培养基中培养，当吸光度600（OD600）达到0.5时加入500μmol的异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG），诱导AfLPMO7蛋白的表达，并用SDS－PAGE电泳验证蛋白是否表达。若蛋白表达，使用亲和层析的方法纯化AfLPMO7蛋白，并使用核酸定量仪（ND－2000，Thermo，USA）测定AfLPMO7的蛋白浓度［5］。

1.2.4AfLPMO7与PASC的吸附实验

吸附实验根据Manjeet的方法［6］稍作改动。底物选择PASC，实验分为两组，一组为仅有AfLPMO7蛋白，另一组为AfLPMO7蛋白和PASC。AfLPMO7的蛋白浓度为0.5 mg／mL，PASC的浓度为10 mg／mL，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），反应温度为50℃，转速为200 r／min，反应时间为2 h。反应结束后，10 000 r离心2 min，固液分离，并将PASC用PBS洗涤3次。最后用50μL PBS重悬PASC，加入10μL蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，10 000 r离心2 min后取上清，进行SDS－PAGE电泳，检测吸附在底物上的AfLPMO7蛋白含量。

1.2.5AfLPMO7对PASC和Xylan的降解实验

将AfLPMO7与过量氯化铜逐步混合，室温静置20 min。使用50 mmol醋酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡脱盐柱G25，将混合物流经脱盐柱，并用50 mmol醋酸钠缓冲液冲洗脱盐柱，收集蛋白溶液，即得到Cu2＋－AfLPMO7。以下酶活力实验均用Cu2＋－AfLPMO7。

1 mL的反应体系包括底物PASC（1%）或者Xylan（1‰），1μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol的没食子酸，50 mmol醋酸钠缓冲液（pH 5.0）。反应温度为50℃，转速为150 r／min，反应时间为12 h。在同等条件下设置灭活的AfLPMO7蛋白作为对照（CK）。反应结束后，将样品沸水浴5 min后，10 000 r离心10 min，取上清，加入等量DNS，沸水浴5 min，在波长540 nm处测吸光度，计算还原糖的含量［7］。

1.2.6AfLPMO7与纤维素酶对天然底物的糖化实验

1 mL的反应体系包括1%水稻秸秆、1%小麦秸秆、1%玉米秸秆，0.05 U纤维素酶，1.0、2.0和3.0μmol Cu2＋－AfLPMO7，2 mmol没食子酸，50 mmol醋酸钠缓冲液（pH 5.0）。反应温度为50℃，转速为150 r／min，反应时间为24 h。反应结束后，计算还原糖的量。

1.2.7AfLPMO7动力学实验

动力学实验根据Breslmayr的方法［8］稍作改动。将2，6－DMP作为底物。1 U的酶活力定义为每分钟产生1μmol木醋醌（coerulignone）的LPMO的量。缓冲液分别选择50 mmol醋酸钠缓冲液（pH 5.0）和PBS（pH 7.4），辅助因子H2O2的浓度为100μmol，反应温度为30℃，在同等条件下设置灭活的AfLPMO7蛋白作为对照（CK）。反应结束后，在波长469 nm处测吸光度，计算coerulignone的量。

1.2.8AfLPMO7的同源建模和分子对接

AfLPMO7的同源建模采用AlphaFold2 server（https：／／colab.research.google.com／github／deepmind／alphafold／blob／main／notebooks／AlphaFold.ipynb＃scrollTo＝woIxeCPygt7K）。活性中心的预测采用在线预测网站Zhang Lab（https：／／zhanglab.ccmb.med.umich.edu／）。

用Vina［9－10］软件进行分子对接实验。以预测的AfLPMO7结构为受体、纤维六糖为配体，分别添加氢原子使其为质子化状态，并计算扭转分支中心和配体扭转自由度。将His3、His85和Tyr163视为柔性，受体坐标分为刚性部分和柔性侧链。最后，设置参数（包含全部可变换氨基酸的大网格）运行Vina程序。

2 结果与分析

2.1 Af LPMO7的序列分析

AfLPMO7的进化树结果见图1（a），由图1（a）可知，AfLPMO7蛋白与多数AA9家族蛋白具有较近的亲缘关系，其中具有最近关系的为PsAA9蛋白（PDB数据号：7PQR），它们的氨基酸相似度为33.36%，又与部分内切葡聚糖酶具有一定的亲缘关系。基于CDD比对结果对AfLPMO7蛋白进行功能区预测见图1（b）。由图1（b）可知，AfLPMO7蛋白N端具有一个AA9家族功能模块，中间部分为蛋白linker，起到连接蛋白质N端和C端的作用，C端为一个CBM1功能区，确认AfLPMO7蛋白为AA9家族蛋白。

2.2 Af LPMO7的表达纯化和底物吸附实验

AfLPMO7蛋白存在于大肠杆菌细胞内，将细胞破碎，经过镍柱分离纯化后得到其纯化蛋白。经SDS－PAGE电泳验证后，结果如图2（a）所示，泳道1为纯化后的AfLPMO7蛋白，其大小约为38 kDa，与理论预测值一致，表明其表达成功。

图2 Af LPMO7的SDS－PAGE电泳及底物吸附结果

在AfLPMO7蛋白对PASC的吸附实验中，经过2 h的结合，结果如图2（b）所示，泳道2为不加底物的蛋白含量，泳道3为反应体系中未吸附的AfLPMO7蛋白，结果表明游离蛋白减少了较多的量。吸附在底物PASC的AfLPMO7蛋白含量如图2（c）所示，其中泳道4～6均为吸附在PASC的AfLPMO7蛋白。结果表明AfLPMO7蛋白对PASC具有较强的吸附能力。

2.3 Af LPMO7对PASC和Xylan的直接降解及与纤维素酶对天然底物的糖化作用

PASC和Xylan分别为纤维素和半纤维素，将其作为底物研究AfLPMO7蛋白的酶活力。如图3（a）所示，AfLPMO7作用于PASC时，产生了浓度为17.12μg／mL的还原糖，作用于Xylan时，产生了浓度为41.24μg／mL的还原糖，表明AfLPMO7能作用于纤维素和半纤维素，且对半纤维素的降解能力较强。

图3 Af LPMO7对底物的直接作用及与纤维素酶对天然底物的糖化作用

本文主要研究AfLPMO7与纤维素酶协同降解天然底物。如图3（b）所示，当以水稻秸秆为底物时，经过24 h反应后，与仅加入纤维素酶相比，分别添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了37.53%、111.89%和87.69%。如图3（c）所示，当以小麦秸秆为底物时，经过24 h反应后，与仅添加纤维素酶相比，分别添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了20.48%、35.55%和38.82%。如图3（d）所示，当以玉米秸秆为底物时，经过24 h反应后，与仅添加纤维素酶相比，分别添加1.0μmol、2.0μmol和3.0μmol的AfLPMO7蛋白，糖化率依次提高了29.97%、50.95%和22.05%。说明AfLPMO7蛋白能有效地协助纤维素酶降解天然底物，如水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆等。

2.4 Af LPMO7的动力学实验分析

为了探究AfLPMO7蛋白的反应速率，选择2，6－DMP作为底物，H2O2浓度为100μmol，测定AfLPMO7蛋白的动力学参数。在50 mmol醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中，AfLPMO7的Vmax值为109.99±3.91 U／g，Km值为2.82±0.33 mmol（见图4（a））。在PBS（pH 7.4）中，AfLPMO7的Vmax值为91.07±1.28 U／g，Km值为0.52±0.05 mmol（见图4（b））。

图4 不同pH条件下Af LPMO7的米氏曲线

2.5 Af LPMO7的同源建模和活性中心的预测

使用AlphaFold2 server对AfLPMO7进行同源建模，生成的结构如图5（a）所示，AfLPMO7的主体由AA9家族蛋白功能区和CBM1（红色部分）组成。AA9家族蛋白功能区的核心由8个反向平行的β折叠（粉红色）和3个α螺旋（紫色部分）组成。其活性中心位于蛋白平坦的表面，活性中心His3、His85和Tyr163氨基酸残基组成了其铜离子活性中心（见图5（b））。

图5 Af LPMO7的三维结构图

2.6 Af LPMO7的分子对接

采用分子对接技术探究AfLPMO7与纤维素的结合位点。模拟运算后，选取能量最小的作为对接模型，其能量为－9.2 kcal／mol。在AfLPMO7与纤维六糖的对接模型（见图6（a））中，纤维六糖分子悬浮在AfLPMO7蛋白表面，且接近其活性中心的铜离子，此外还有4个氨基酸（Ser33、Thr36、Arg74、Gly159）与纤维六糖分子之间形成了氢键，并以此相互作用（见图6（b））。图6（c）为相互作用的二维可视化图，结果表明AfLPMO7与纤维六糖的作用方式不仅有氢键，还有疏水作用（His3、Asn31、Thr73）。

图6 Af LPMO7与纤维六糖的分子对接

3 讨论与结论

AA9家族LPMOs是一类能有效协助纤维素酶降解纤维素的辅酶，可对纤维素多糖链进行破坏，使多糖链的结构变得疏松，进而促进纤维素水解酶进一步降解纤维素。在对AA9家族蛋白的研究中，着重研究其对纤维素的吸附作用，只有酶与底物结合，才能更好地发挥作用。评价AA9家族LPMOs对纤维素的吸附能力有两种方法，一种是反应体系游离蛋白的减少，另一种是吸附于纤维素的蛋白量，均用SDS－PAGE电泳结果直接显现。AfLPMO7具有一个CBM1模块，表现出对纤维素具有较强的吸附能力。其他AA9家族蛋白如HjLPMO9A（来源于Hypocrea jecorina），在其蛋白C端，同样具有一个CBM1功能区，因而也表现出对PASC具有较强的吸附能力［11］。此外，还有AA9家族蛋白携带名为X278的保守结构域，由4个半胱氨酸残基和1个芳香残基组成，可能具有与CBM相似的功能［12］。

AfLPMO7蛋白能够作用于PASC和Xylan并产生还原糖，证明其能够作用于纤维素和半纤维素。已有研究认为大部分AA9家族蛋白只能作用于纤维素底物，极少数能作用于半纤维素底物，同时能对木葡聚糖产生作用，如来源于Malbranchea cinnamomea的PMO9A＿MALCI［13］。AfLPMO7能与纤维素酶协同作用，提高纤维素酶对水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆的水解效率，提高幅度为20.48% ～111.89%。表明AfLPMO7能有效降解秸秆中难降解的部分，如木质素。一般认为，木质素对于纤维素的水解有着不利影响，但是由于AA9家族蛋白的特殊性，木质素反而会成为其降解纤维素的重要辅助因子，因为低分子量木质素具有二聚体和三聚体两种主要构象，这种具有一簇pi－轨道的结构有利于未配对电子的稳定性，使木质素成为一种有效的电子供体［14］。

在对AfLPMO7蛋白的动力学参数测定中，在50 mmol的醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中，AfLPMO7具有最高的Vmax值，为109.99±3.91 U／g，Km值为2.82±0.33 mmol，表明AfLPMO7蛋白在此pH下，具有较高的氧化能力。AfLPMO7表现的氧化能力稍强于LPMO9F（来源于Neurospora crassa），这种差别可能与其蛋白质结构相关，尤其是铜离子活性中心的不同，这将影响AA9家族蛋白接受电子的能力［8］。AfLPMO7蛋白的Km值小于3 mmol，表明其铜离子活性中心进化为能结合2，6－DMP的结构。也有研究表明漆酶能有效地结合2，6－DMP，其Km值从15μmol到1 000μmol，尽管漆酶比AA9家族蛋白对2，6－DMP具有更强的结合能力，但是在木质素降解过程中，AA9家族蛋白的酶活力优于漆酶［15］。此外，在自动建模和分子对接实验中，发现AfLPMO7蛋白铜离子活性中心由His3、His85和Tyr163氨基酸残基组成，而其与纤维六糖结合的氨基酸为Ser33、Thr36、Arg74、Gly159，表明催化中心不一定为结合部分。

在本研究中，来源于Aspergillus fumigatusZ5的AfLPMO7蛋白被定性。AfLPMO7对PASC具有很强的吸附能力，能直接作用于PASC和Xylan，并释放出可溶性产物，且对2，6－DMP具有较强的氧化能力，并能协助纤维素酶有效降解天然底物。该结果为更好地利用AA9家族蛋白提供了一定的支持。