不同污水处理厂活性污泥微生物多样性差异分析

郭 枫，张文俊，张俊霞，刘 彪，扶咏梅，胡红伟

（1.河南城建学院河南省水体污染防治与修复重点实验室，河南 平顶山 467036；2.华北水利水电大学环境与市政工程学院，河南 郑州 450011）

活性污泥法具有处理效率高和运行成本低等优势，被广泛用于污水处理［1］。微生物是活性污泥的重要组成部分，微生物群落驱动着污染物的降解和转化，直接影响污水处理厂的处理效率和稳定性［2－3］。因此，研究污水处理厂中微生物群落结构和功能对深入了解污水生物净化的机制具有重要意义。

近年来，通过高通量测序技术对活性污泥微生物群落进行研究，获得了许多成果。Ibarbalz等［4］研究了8个污水处理厂好氧处理单元的活性污泥样本，发现污水特征是驱动微生物群落结构组装的决定因素。市政污水主要来源于日常生活产生的污水，其有机物质主要包括蛋白质、糖类、纤维等［5］。研究表明，市政污水处理厂活性污泥微生物群落的优势种群主要为Proteobacteria和Bacteroidetes［6－8］。

工业废水的特点与市政生活污水存在显著的差异，不同类型的工矿企业在生产过程中产生的废水具有不同的特点，大多数工业废水可生化性较差，需经预处理提高其可生化性，再进行生物处理。在生物处理过程中，微生物群落结构与废水的组成密切相关。Yang等［9］发现，在工业废水活性污泥中Nitrospira较市政污水低，表明工业废水的复杂性影响硝化和反硝化过程。在巧克力生产废水中，Firmicutes是最为优势的微生物群落［10］，而在石化废水中，以Proteobacteria为主导的微生物种群对复杂化合物具有良好的降解性能［11］。赵婷婷等［12］研究了淀粉废水处理系统中微生物群落，发现最重要优势细菌类群为Proteobacteria。可见，不同类型污废水中活性污泥微生物群落组成各有特点。

本研究通过Illumina MiSeq高通量测序技术，以16SrRNA基因的V4区为靶基因，对7个污水处理厂好氧生物处理单元中的微生物群落结构进行研究，其中5个来自市政污水处理厂，2个来自工业废水处理厂（尼龙化工和氯碱化工）。研究结果将对市政污水处理厂和工业废水处理厂活性污泥微生物群落结构差异的认识和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2019年1月对市政污水处理厂和工业废水处理厂的好氧生物处理单元进行了采样，采样深度为10～30 cm，分别标记样本为BF、BY、PDS、YZA、YZB和LJ、LLY。采集后，样本立即被置于无菌聚乙烯容器中，在低温条件下保存，并在2～3 h内运送至实验室。BF、BY和PDS生物处理工艺为奥贝尔氧化沟，YZA和YZB生物处理工艺为厌氧－缺氧－好氧联合工艺（A2O）。LJ样本来自氯碱化工厂，该厂主要生产烧碱和聚氯乙烯等化工原料，废水在中期和后期采用接触氧化法进行处理。LLY样本来自尼龙化工厂，该厂主要生产己内酰胺、环己醇和环己酸，废水经氨肟化预处理后采用MSBR工艺进行处理。

1.2 理化指标测定

采用便携式测量仪（Hanna HI98130，意大利）测定pH值，采用重铬酸盐法测定化学需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD），采用纳氏试剂法测定氨氮（NH4－N），采用酚二磺酸法测定硝酸盐氮（NO3－N），采用N－（1－萘基）－乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐氮（NO2－N），采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定总氮（Total Nitrogen，TN）。上述测定均使用紫外可见分光光度计（普析T6，北京）。

1.3 高通量测序分析

采用0.2μm孔径的混合纤维滤膜进行生物样本收集。使用DNA试剂盒（OMEGA E.Z.N.ATMMag－Bind DNA Kit，US）从7个污水处理厂的活性污泥中提取微生物DNA。使用Qubit2.0DNA定量系统（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）测量DNA浓度。微生物多样性鉴定区域为16S rRNA基因的V4区，使用引物515F：5′－GTGCCAGCMGCCGCGGTAA－3′和806R：5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′。经PCR扩增和纯化，使用Illumina MiSeq平台进行测序。高通量测序由生工生物技术（上海）有限公司完成。原始数据经预处理后按照序列相似性大于97%聚类为一个OTU（Operational Taxonomic Unit）。原始测序数据已存入NCBI序列读取档案（SRA）数据库，登录号为：SRP332584。

1.4 数据分析

使用R（版本4.2.1）中的vegan包计算样本α多样性指数［13］。使用SPSS 25.0进行环境因子与α多样性指数之间的Pearson相关性分析。使用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）方法分析微生物对环境因子的响应关系［14］，数据处理及可视化使用R语言中的vegan、plyr和ggplot2包。使用主坐标分析（Principal Co－ordinates Analysis，PCoA）方法分析各样本的β多样性差异［15］，数据处理及可视化使用R语言vegan、ape和ggplot2包。使用PICRUSt2基于测序数据和直系同源集簇（Clusters of Orthologous Groups，COG）数据库对各样本微生物群落进行功能注释［16］。

2 结果与分析

2.1 环境因子分析

本研究中所获得的样本环境因子数据如表1所示，7个样本的pH值均大于7，其中LJ的pH值最大。NH4－N、NO3－N和NO2－N的范围分别为1.41～12.60 mg·L－1、0.28～5.24 mg·L－1和0.02～2.55 mg·L－1。COD的范围为100.00～420.00 mg·L－1，其中LJ的COD值为340 mg·L－1，LLY的COD值为420 mg·L－1。工业废水处理厂样本COD和pH值均高于市政污水处理厂。此外，PDS的TN浓度最低为11.48 mg·L－1，LJ的TN浓度最高达到109.33 mg·L－1。

表1 污水处理厂好氧处理单元水样环境因子

2.2 微生物多样性和相关性分析

各样本微生物α多样性指数如表2所示。

表2 活性污泥微生物α多样性

由表2可知，市政污水的香农指数均大于5，而工业废水香农指数则均小于3。工业废水中的辛普森指数均大于0.1，而市政污水中的辛普森指数为0.01。市政污水处理厂的ACE指数均在2 100以上，而工业废水的ACE指数均在500以下，其中LLY的ACE指数最低，仅为346.07。市政污水的Chao1指数均超过2 000，而工业废水的Chao1指数均低于500。总体而言，工业废水处理厂样本微生物群落多样性低于市政污水处理厂。环境因子与微生物α多样性指数的皮尔逊相关性分析表明，pH和COD浓度与微生物多样性呈显著负相关（p＜0.05）（见表3）。

表3 环境因子与微生物α多样性指数的皮尔逊相关性

2.3 微生物群落结构及样本聚类分析

在门水平上（见图1（a）），市政污水处理厂和工业废水处理厂的微生物群落相对丰度存在差异，其主要的微生物门类包括Proteobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Actinobacteria和Deinococcus－Thermus。在7个样本中，Proteobacteria是最具优势的微生物，在市政污水处理厂样本中占比31.40%～43.97%，在工业废水处理厂LJ和LLY分别占86.78%和58.77%。在LLY 中，Deinococcus－Thermus的相对丰度为20.57%，在其他6个样本中的相对丰度均低于0.1%，显示出LLY具有独特的微生物群落。

图1 微生物群落结构及样本聚类分析

在属水平上（见图1（b）），市政污水中优势菌属主要包括Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium，LJ和LLY的微生物群落组成与市政污水存在较大差异。在LJ中，最优势的微生物菌属包括Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter，其中Acinetobacter在LJ的相对丰度最高，而在其他样本中均低于2%。在LLY中，最优势的微生物菌属包括Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas，其中Meiothermus在LLY中的相对丰度为19.72%，而在其他样本中未检测到。

基于Bray－Curtis距离的PCoA分析结果显示（见图1（c）），市政污水处理厂和工业废水处理厂的活性污泥在样本聚类上相互分离，两个工业废水厂样本均远离市政污水厂样本。基于OTU水平的RDA分析结果显示（见图1（d）），pH对微生物群落分布有显著的影响（p＜0.05）。

2.4 功能基因多样性及丰度

基于COG的功能基因分析表明，市政污水处理厂和工业废水处理厂样本在功能基因的多样性上差异较小（见图2（a）），但在聚类（见图2（b））及其丰度分布（见图2（c））上存在较大差异。市政污水处理厂样本形成聚类，而工业废水处理厂样本则与其有较大的分离。功能基因丰度热图则揭示了在污水处理中，能源生产与转换（Energy production and conversion）、氨基酸运输与代谢（Amino acid transport and metabolism）、碳水化合物运输与代谢（Carbohydrate transport and metabolism）、细胞壁／膜／包被生物发生（Cell wall／membrane／envelope biogenesis）以及信号转导机制（Signal transduction mechanisms）等类别的功能基因至关重要。特别是，LJ中这些功能基因的丰度普遍低于其他样本，而LLY中这些功能基因的丰度则普遍高于其他样本。市政污水处理厂样本之间在功能基因丰度上的差异相对较小。

图2 基于COG的功能基因分析

3 讨论

微生物群落结构与环境因子之间存在密切关系，但特定废水组成对微生物群落的影响较为复杂。污废水处理过程中，微生物受到有机负荷、pH、温度、溶解氧等多种因素的影响。本研究中，LJ的高pH与烧碱等产品生产过程中排放的废水性质密切相关，而LLY的高COD浓度与己内酰胺、环己醇生产过程中排放的碳源相关。同时，工业废水处理系统中活性污泥微生物群落具有独特的结构，且pH和COD对活性污泥微生物群落的形成有较大影响，该结果与Xu等［17］的研究结果相似。COD与废水中有机质的种类和浓度相关，而pH与微生物的代谢环境相关，二者的共同作用导致了其独特的微生物群落结构。已有研究表明，废水的类型被认为是引起活性污泥系统中微生物群落结构差异最重要的原因［18］，与本研究的结果相符。

本研究中，7个污水处理厂样本微生物群落结构存在差异。市政污水处理厂样本在门水平上的微生物群落组成与之前的研究相似［8，19］。工业废水处理厂样本则表现出独特的微生物群落结构，与市政污水处理厂中常见的微生物群落组成有较大差异［20］。此外，工业废水处理厂样本微生物群落α多样性较低，与Yang等［9］研究结果一致。特别是在LJ中，优势菌属Acinetobacter和Novosphingobium具备降解多环芳烃的能力［21－22］，Polynucleobacter在降解有机物方面具有优势［23］，这与其废水特点具有密切的关联。同时，LLY中特有菌属Meiothermus是造纸厂废水处理系统中常见的微生物［24］，并在陆地热泉中被发现［25］。己内酰胺生产过程中有大量有机物和温废水的排放，原因可能是存在大量的Meiothermus。

微生物群落的基因功能主要集中在氨基酸转运和代谢、转录、细胞壁／膜／包膜生物发生、能量产生和转换以及信号转导机制等方面，这些功能与废水的特性存在关联，如参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等。尽管不同污水处理厂样本的功能基因多样性指数相接近，但功能丰度存在差异。在LJ中，优势功能基因的丰度低于其他样本，这可能是单一的废水结构造成的。而在LLY中，氨基酸的转运和代谢以及能源生产与转化功能基因均高于其他样本，这表明在工业废水的影响下相关的代谢功能得到了增强。此外，以往研究表明，在高盐环境的胁迫下，微生物群落可发展出特定的代谢模式以维持细胞活性［26］，这也可能是造成工业废水处理厂微生物功能差异的潜在原因。

4 结论

（1）工业废水处理系统中微生物群落多样性和丰富度均低于市政污水处理厂。本研究中，微生物群落α多样性指数与pH和COD呈显著负相关。

（2）来自市政污水处理系统的5个样本，优势菌属均为Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium。工业废水处理系统则存在差异，在LJ中，Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter为优势菌属，在LLY中，Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas为优势菌属。

（3）基于COG数据库的功能基因预测显示，工业废水处理厂和市政污水处理厂样本在功能基因多样性上差异性较小，但在优势功能基因的丰度上存在较大差异。这种差异是由工业废水和市政污水特性所导致的。