当归根际丛枝菌根真菌群落及其影响因子分析

巩晓芳,薛林贵,杨 玲,陈玉坤,彭轶楠,祝 英,王治业

(1. 兰州交通大学 生物与制药工程学院,兰州 730070;2. 甘肃省科学院生物研究所 甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,兰州 730000)

当归(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)属于伞形花科,为多年生草本植物,是我国传统中药材之一,其味甘、辛,性温,归肝、心、脾经,具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效,在中药材中具有“十方九归”的地位[1]。甘肃省岷县是我国优质当归的主产区[2],岷县当归被称为“岷归”,岷归因产量高和品质优而享有“岷归甲中华”的美誉[3]。近年来,因当归的连作障碍及病虫害频发,导致当归产量和品质逐年下降,不仅使药农的收入降低还影响地方中药材产业的发展[4]。研究表明中药材的产量和品质除受自身遗传因素决定外,土壤因子(土壤理化特性、土壤养分和土壤微生物等)也是直接影响中药材产量和主要药效成分的重要因素[5]。根际土壤微生物在植物的生长发育过程中起着至关重要的作用,其群落结构对植物生长和健康具有重要的影响[6-7]。姜小凤等[8]研究表明当归根际土壤细菌群落对当归健康生长和药效成分积累具有重要的影响。Zhu等[9]报道了土壤微生物会影响当归生长和药效成分类型的形成。因此,研究土壤微生物在当归生长中的变化特征对研究当归品质形成理论及其调控具有重要意义。

丛植菌根真菌(AMF)是一类有益的土壤微生物,能与80%以上的陆生植物形成互惠共生体—菌根[10],菌根有助于植物借助广泛而发达的菌丝从土壤中获取养分,促进植物的生长,还能增强植物的抗逆性[11],如干旱、盐渍化和重金属毒害。You等[12]研究表明菌根可以去除土壤中的重金属,降低土壤中重金属的积累从而缓解对植物的毒害。仲启祥等[13]报道当归种植土壤重金属中镉的含量最高,当归植株对重金属砷具有明显的吸收特性,但当归植株对镉和砷的富集能力较低。研究表明AMF与中药材也能形成菌根,在中药材的生长过程中发挥有益功效[14]。课题组前期的研究发现,AMF与当归的共生过程中,土壤中AMF的孢子密度和球囊霉素含量随当归的生长发生明显的规律性变化,且AMF参数与土壤因子的相关性显著[15]。但当归不同生长期根际土壤中AMF的多样性及群落结构的特征及其与土壤因子的相关关系尚未见报道。

本研究选择甘肃省定西市岷县当归栽培区,分别在当归的重要生长期:叶丛期、根膨大期和成药期进行采样,采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对当归不同生长期根际土壤AMF多样性及其群落结构进行测序分析,并与当归根际土壤理化因子及土壤重金属镉和砷的测定结果进行关联分析,阐明当归根际土壤AMF多样性和群落结构在当归生长过程中的变化及主要影响因素,为当归的健康生长和品质提升提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品种植区概况

选择甘肃省定西市岷县十里镇(E 103° 57′ 16″,N 34° 29′ 51″)当归栽培区为试验地。岷县为温带半湿润向高寒湿润气候过渡带,高寒阴湿,年均气温5.5 ℃,年降水量635 mm,7-9月为雨水集中期,平均相对湿度68%,年无霜期123 d。土壤为黑钙土,土质黏细,砂质含量低,干后易结块。本研究试验田选择地势较为平坦的地,均匀地移栽品种为“岷归1号”的种苗,定期人工除草管理。

1.1.2 样品采集

选择当归的重要生长期:叶丛期(S期,5月21日)、根膨大期(M期,7月28日)和成药期(H期,10月8日)采样,每期采用5点“S”法选择6个点,采集当归植株和根际土壤。采样时将带有根际土的当归植株放入无菌自封袋,做好标记放入冰盒带回实验室后,轻揉并抖动当归获得根际土样,并将每个土样分成2份,1份装入无菌自封袋,-80 ℃冰箱储存,用于样品高通量测序;另1份自然风干后过筛(0.149 mm),用于土壤pH值、电导率、重金属镉和砷的测定。

1.2 研究方法

1.2.1 样品理化性质及重金属测定

土样pH值采用pH计测定,水土比为1∶2.5;电导率采用电导率仪测定,水土比为1∶2.5。重金属镉和砷采用硝酸-双氧水-氢氟酸多酸消解,用ICP-OES/MS测定元素含量[13,15]。

1.2.2 样品DNA提取

1.2.3 PCR扩增和测序

1.2.4 高通量测序数据分析

使用fastp[17]软件对双端原始测序序列进行质控,再用Flash[18]软件进行拼接,然后使用Uparse[19]软件,根据97%的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元OTU(operational taxonomic unit)聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier[20]比对maarjam20220506/AM数据库进行OTU物种分类学注释,置信度阈值为70%,并在不同物种分类水平统计每个样本的群落组成。

1.2.5 数据统计分析

多样性数据及土壤因子关联分析均在美吉生物云平台上进行,具体如下:采用mothur[21]软件计算Alpha多样性指数;使用基于bray-curtis距离算法的PCoA分析检验样本间微生物群落结构的相似性。采用Wilxocon秩和检验进行物种组成差异分析;基于Pearson相关性|r|>0.6,p<0.05 挑选物种进行相关性分析,并使用基于距离的冗余分析(distance-based redundancy analysis,db-RDA)用来分析当归根际土壤AMF群落与土壤因子的相关关系,采用R语言工具统计和作图。土壤因子采用SPSS 22软件进行统计分析,然后用Origin Pro 2019 (Origin Lab Corporation,USA) 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 当归不同生长期根际土壤理化性质分析及重金属镉和砷的质量分数测定

当归不同生长期根际土壤理化性质及重金属镉和砷含量变化如图1所示。

图1 当归不同生长期根际土壤理化性质及重金属镉和砷含量的变化

由图1可知,当归根际土壤pH值和土壤电导率(EC)在当归的S期、M期到H期呈明显的下降趋势(见图1(a),1(b)),其中H期当归根际土壤的pH值和EC极显著低于S期和M期(p<0.001),M期的EC极显著低于S期(p<0.000 1)。当归根际土壤重金属镉含量在S期、M期到H期变化差异不显著(见图1(c)),而砷含量在当归的S期、M期到H期显著降低(见图1(d)),其中H期根际土壤中砷的质量分数相比于S期下降了35%,达到极显著水平(p<0.001)。说明在当归的不同生长期根际土壤的理化性质及重金属镉和砷含量具有明显差异。

2.2 当归根际土壤AMF测序信息结果

Illumina MiSeq测序结果显示,所有土样AMF测到的序列长度均集中分布在200～240之间(见图2(a)),序列数在不同土样间具有较大差异,大小依次为:H期>M期>S期。稀释曲线用来反映所抽取的优化测序深度是否合理,由图2(b)可知,抽取的所有样品的序列数均达到12 000条以上,曲线趋向平坦,表明所有样本测序数量充足,测序合理。本研究从当归根际土壤中共获得1 066 554条有效序列,平均每个样品中得到59 253条有效序列。

图2 当归根际土壤AMF测序结果

当归根际土壤AMF高通量测序获得的有效序列经比对NCBI数据库,总共得到137个AMF-OTUs,分属于1门1纲5目9科9属32种。OTU Venn分析如图2(c)所示,图中直观地显示了当归不同生长期根际AMF群落OTU组成的共有和特有物种数。从S期、M期到H期OTU的数目呈增加趋势,H期的OTU数目最多,占总数目的71.53%,S期的OTU数目最少,占总数目的54.74%,M期居中,占总数的62.04%。3个时期共有的OTU数目为35,S期的独有OTU数目最多,占S期总数目的32%;H期的独有OTU数目居中,占H期总数目的18.37%;M期的独有OTU数目最少,占M期总数目的10.59%。

2.3 当归不同生长期根际土壤AMF-α多样性分析

Coverage指数反映群落覆盖度,α多样性指数可以反映微生物群落的丰富度和多样性,Shannon和Simpson指数反映群落的多样性;Sobs、Chao和Ace指数反映群落的丰富度。当归S期、M期和H期根际土壤AMF的α多样性分析结果如图3(a)～3(f),从图3(a)可知当归S期、M期和H期的覆盖度均大于99%,说明测得的AMF物种基本覆盖了当归不同时期根际土壤AMF所有物种。由图3(b)和3(c)可知,在当归不同生长期,H期的Shannon指数显著高于S期和M期(p<0.05),S期和M期之间无统计学差异;Simpson指数为H期低于S期和M期,但三者之间均未达到显著水平;Sobs、Chao和Ace指数均为H期高于S期和M期,三者之间也没有达到显著水平,以上结果说明当归成药期根际土壤AMF的多样性和丰富度均大于叶丛期和根膨大期,且成药期当归根际土壤AMF的多样性显著大于当归叶丛期和根膨大期(p<0.05)。

图3 当归不同生长期根际土壤AMF α-多样性分析

2.4 当归不同生长期根际土壤AMF-β多样性分析

基于bray_curtis距离算法,采用Anosim(analysis of similarities)当归不同生长期根际土壤AMF群落进行组间差异分析,其PCoA分析结果如图4所示。

图4 当归不同生长期根际土壤AMF β-多样性分析

图4表明在OTU水平上(见图4(a)),主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解释方差分别为35.07%和18.83%,累计达53.90%;在属水平上(见图4(b)),主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解释方差分别为71.24%和10.10%,累计达到81.34%。说明本研究中影响当归根际土壤AMF群落结构的主导因子明显(p<0.05),OTU水平和属水平均呈现出当归S期、M期和H期有相交部分也有独立的部分,说明当归不同生长期根际土壤AMF群落的组成具有一定的差异,反映了当归根际土壤AMF群落组成随着当归的生长在不断变化。

2.5 当归不同生长期根际AMF组成分析

当归根际土壤AMF的组成如图5所示。

图5 当归不同生长期根际土壤AMF组成

从属水平分析,不同样品间的组成具有明显差异(见图5(a),5(b)),当归根际土壤AMF在属水平上的组成,包括:球囊霉属(Glomeraceae)、多孢囊霉属(Diversisporaceae)、Unclassified_c_Diversisporales属、无梗囊霉属(Acaulosporaceae)、Unclassified_c_Glomeromycetes属、巨孢囊霉属(Gigasporaceae)、类球囊霉属(Paraglomus)、原囊霉属(Archaeospora)和双型囊霉属(Ambispora)。优势菌为球囊霉属(Glomeraceae)和多孢囊霉属(Diversispora),其中球囊霉属的丰度要明显高于多孢囊霉属,球囊霉属的丰度在S期、M期和H期的平均值分别为61.84%,71.97%和75.15%,表明球囊霉属随当归的生长丰度逐渐增加;而多孢囊霉属的丰度在S期、M期和H期的平均值分别为25.13%,25.77%和16.50%,表明多孢囊霉属随当归的生长丰度逐渐减少(图5(b))。图5(c)是当归根际AMF属水平组成的三元相图,其中球囊霉属(Glomeraceae)占比为69.7%,S、M和H贡献度分别为29.6%,34.4%和36.0%;多孢囊霉属(Diversisporaceae)占22.5%,S、M和H贡献度分别为37.3%,38.2%和24.5%;而Unclassified_c_Diversisporales属、无梗囊霉属(Acaulosporaceae)、巨孢囊霉属(Gigasporaceae)和Unclassified_c_Glomeromycetes属等的占比均低于3.5%。以上结果说明球囊霉属是当归根际AMF的绝对优势属。

2.6 当归不同生长期根际AMF物种差异分析

采用Wilxocon秩和检验对不同生长期当归根际AMF的物种组成差异进行分析,由表1可知,在当归的S期、M期和H期,当归根际土壤AMF的优势菌,球囊霉属(Glomeraceae)和多孢囊霉属(Diversisporaceae)及非优势菌,无梗囊霉属(Acaulosporaceae)、Unclassified_c_Glomeromycetes、巨孢囊霉属(Gigasporaceae)、Unclassified_f_Diversisporaceae属、类球囊霉属(Paraglomus)、原囊霉属(Archaeospora)和双型囊霉属(Ambispora)均无显著差异(p<0.05),仅Unclassified_o_Diversisporales属在S期、M期和H期的丰度具有显著差异(p<0.05),说明当归根际土壤AMF中Unclassified_o_Diversisporales属的丰度对当归的不同生长期响应明显。

表1 不同生长期当归根际AMF物种组间差异分析结果

2.7 当归根际土壤因子与AMF关联分析

当归根际土壤理化因子,镉和砷含量与当归根际土壤AMF菌群的丰度的相关性分析结果表明(见表2),土壤pH值与unclassified_c__Glomeromycetes属极显著正相关(p<0.01),与unclassified_o__Diversisporales属和原囊霉属(Archaeospora)显著负相关(p<0.05),而与巨孢囊霉属(Gigasporaceae)极显著负相关(p<0.01);无梗囊霉属(Acaulospora)与土壤电导率和土壤重金属镉和砷均为显著正相关(p<0.05);重金属镉与类球囊霉属(Paraglomus)显著负相关,与双型囊霉属(Ambispora)显著正相关(p<0.05),说明当归根际土壤理化因子及镉和砷含量对当归根际土壤AMF菌群的丰度具有一定的影响。

表2 当归根际土壤AMF优势菌与土壤理化性质及镉和砷质量分数的相关系数

基于bray_curtis距离算法,采用db-RDA分析对当归根际土壤因子与AMF菌群进行关联分析,结果如图6所示。图6(a)中显示土壤pH值与Shannon指数和丰富度指数Ace指数为正相关,而与Simpson指数负相关;Shannon指数、Ace指数和Chao指数与土壤电导率、镉和砷均为负相关;当归根际土壤pH值和电导率对AMF菌群的影响相对弱于土壤重金属镉和砷,土壤重金属镉对AMF菌群的影响大于砷。说明当归根际土壤AMF的多样性、丰富度和菌群结构对当归根际土壤理化因子和重金属镉和砷含量均有明显的响应。

图6 当归根际土壤AMF与土壤因子的db-RDA和VPA分析

VPA分析显示(见图6(b)),当归根际土壤因子对AMF菌群影响因素的可解释度为71.46%,其中重金属镉和砷的单独解释度最高,为45.24%,土壤理化性质pH值和电导率的单独解释度为33.52%,AMF多样性的单独解释度较低,仅为16.25%,说明当归根际土壤中重金属镉和砷对AMF菌群的影响作用较大,是本研究中AMF菌群的主要驱动因子。

3 讨论

研究表明AMF在其共生植物的生活史中会不断发生变化,其中土壤理化性质是引起AMF群落结构变化的重要因素之一[22]。本研究中土壤pH值随当归的生长显著降低(见图1(a)),且土壤pH值与多个AMF属为负相关,其中与巨孢囊霉属(Gigasporaceae)极显著负相关(p<0.001)(见表2),可能是随着当归的生长发育,当归根系分泌的有机酸类物质在土壤中逐渐累积[23],使土壤向微酸性变化(见图1(a)),因AMF喜好微酸性土壤,适宜的土壤环境有利于AMF的生长,使AMF菌群的多样性和丰富度增加,这与前人的研究结果一致[24],说明土壤 pH值是驱动AMF多样性和群落变化的主要驱动因子之一。土壤电导率是反映土壤盐浓度的重要参数,土壤盐浓度对AMF有着重要影响,研究表明土壤盐浓度过高会缩短AMF菌丝芽管的发育而抑制AMF菌丝的分支,还会使植物叶绿素含量减少而使植物光合作用强度降低,导致宿主植物地下根部获得的光合产物减少而影响AMF的生长和发育[14]。本研究中从当归的S期到H期,根际土壤的电导率显著下降(见图1(b)),当归根际土壤AMF多样性指数Shannon指数显著增大,丰富度指数Ace和Chao指数明显增大(见图3),且相关性结果表明土壤电导率与AMF多样性指数Shannon指数和丰富度指数Ace和Chao指数均为负相关(见图6(a)),说明较低的土壤电导率更利于当归根际土壤AMF多样性和丰富度的增大。

本研究除了土壤pH值和电导率两个重要土壤因子外,还证实了土壤重金属Cd和As也是AMF群落结构的重要驱动因子,且相比于土壤pH值和电导率,土壤重金属Cd和As对AMF菌群的影响更明显(见表2,图1和图6)。You等[25]研究表明AMF能促进宿主植物对重金属Cd的吸收,而本研究中当归根际土壤重金属Cd含量从当归的S期到H期没有发生显著的变化(见图1(c)),说明AMF没有明显促进当归植株对重金属Cd的吸收,这可能与土壤中磷元素的运输有关[25],也可能与Cd浓度有关,张淑彬等[26]研究表明低浓度的Cd含量刺激AMF菌丝的生长,但是当Cd浓度大于AMF的耐受值后会影响甚至抑制AMF菌丝的生长。本研究中AMF多样性和丰富度随着当归的生长呈增大的变化趋势(见图3),可能是当归根际土壤中Cd浓度低于AMF的耐受值,而对AMF的生长发育发挥正效应。本研究中土壤重金属As与当归根际土壤AMF多样性指数和优势菌球囊霉属(Glomus_f_Glomeraceae)均为负相关(见图6(a)和表2),这与前人的研究结果一致[27],表明重金属As会影响AMF的多样性和丰富度。也有研究表明As胁迫下,AMF能有效提升宿主植物对微量元素及水分的吸收,从而显著促进宿主植物根系的发育和植株的生长,为AMF提供了更好的生长条件[28]。这与本研究结果的不同之处是本研究中当归根际土壤中的As含量随当归的生长逐渐降低(见图1(d)),即As对AMF的胁迫效应逐渐减弱,而AMF的多样性和丰富度却增大,这可能是因为重金属经过AMF菌丝后,菌丝的过滤作用使重金属不易进入宿主植物而积累在AMF菌丝中,待宿主植物完成生活史后AMF菌丝随之分解而将积累的重金属释放回环境[28]。因此,虽然土壤中重金属As的含量在当归生长期有所下降,但As对AMF的胁迫没有减弱,所以AMF多样性和丰富度增加。

微生物对不同营养物质的偏好性决定了不同植物根系分泌物对不同土壤微生物的招募[29],导致不同植物根系的微生物菌群组成差别较大,而呈现特定宿主植物独特的AMF群落[30]。本研究中随当归的生长,当归根际土壤AMF的多样性和物种丰富度明显增加,当归根际土壤AMF菌群结构在当归的生长中呈现明显的变化(见图4),主要原因是随着当归植株及地下茎的不断生长,为AMF提供了更好的宿主营养体,有利于AMF的多样性和丰富度增大,引起AMF的菌群结构出现一定的变化。研究表明球囊霉属具有特有的繁殖方式,能够耐受不同环境的变化而分布广泛,因此是不同生态系统AMF群落的主要成员[31],本研究中当归根际土壤AMF的优势属为球囊霉属(Glomus_f_Glomeraceae)和多孢囊霉属(Diversispora),随着当归的生长,次优势属多孢囊霉属的丰度逐渐下降,而球囊霉属的丰度逐渐增加,成为当归根际AMF的绝对优势属(见图5),表明球囊霉属是当归根际土壤AMF的特定优势属,这与其它药用植物的研究结果一致[32]。但是不同植物根际AMF的次优势属和低丰度的属之间具有很大差异[24,30-32],这可能是不同植物根际呈现独特AMF群落的原因。而本研究中仅Unclassified_o_Diversisporales属的丰度对当归的不同生长期响应明显(见表1),该属在当归的生长中是否发挥特定作用还需进一步研究。

4 结论

本研究发现在当归不同生长期根际土壤AMF的多样性和菌群结构具有一定的差异,当归成药期的根际土壤AMF多样性和丰富度最大;在当归的不同生长期当归AMF菌群的优势菌为球囊霉属(Glomus_f_Glomeraceae)和多孢囊霉属(Diversispora),随当归的生长,多孢囊霉属的丰度逐渐降低而球囊霉属的丰度逐渐增加成为绝对优势属;仅Unclassified_o_Diversisporales属的丰度对当归的不同生长期响应显著;当归根际土壤pH、电导率和重金属镉和砷的含量共同影响当归根际土壤AMF的多样性和丰富度,但土壤重金属镉和砷含量对AMF菌群的影响较大,为AMF菌群的主要驱动因子。以上结果可为当归的生态种植和品质提升提供参考。