降糖舒心方混悬液灌胃对大鼠糖尿病心力衰竭的治疗作用及其机制

2024-01-09蒋晓凤陈佳俊黄光明申亚亚符显昭

山东医药 2023年36期

蒋晓凤，陈佳俊，黄光明，申亚亚，符显昭

1 右江民族医学院临床医学院，广西百色 533000；2 右江民族医学院附属医院康复医学科；3 右江民族医学院附属医院中医科

糖尿病（DM）是一组由遗传因素和环境因素共同引起的代谢性疾病，随着生活方式的改变以及人口老龄化的加快，DM 的患病率呈上升趋势，据世界卫生组织预测，到2030 年DM 将成为第七大死亡原因［1］。研究［2］表明，DM 是心力衰竭（HF）的独立危险因素，使患HF 的风险增加2～5 倍。DM 引起HF 的病因病机包括高血糖、高血脂、炎症反应、心脏自主神经失调等［3］。目前，针对DHF的治疗尚无特效药，西药治疗主要集中在降糖方面，通过控制血糖缓解疾病，但西药治疗存在较多不良反应，存在容易产生药物依赖性等缺点。中药治疗具有多靶点、多途径和不良反应相对较小的优势，因此探索中医药治疗DHF具有重要意义。降糖舒心方具有“滋阴益气、活血解毒”的作用，可改善DM 代谢紊乱，提高抗氧化应激能力，通过抑制内质网应激凋亡通路缓解心肌细胞凋亡，对DM 大鼠心肌损伤具有保护作用［4］。2022 年7 月—2023 年2 月，我们观察了降糖舒心方混悬液灌胃对大鼠DHF 的治疗作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 雄性大鼠50 只，体质量（230 ±10）g，购自广西医科大学实验动物中心，许可证编号为SCXK（桂）2014-002。饲养于右江民族医学院动物实验中心，温度（23 ± 2）℃，湿度45%～60%，光照/黑暗各12 h循环，适应性喂养7 d。

1.2 主要试剂与仪器链脲佐菌素（北京华越洋生物公司），血糖测试仪（上海玉研科学仪器有限公司），高脂饲料（江苏省协同生物工程有限公司），格列喹酮（北京万辉双鹤药业有限责任公司），贝那普利（北京诺华制药有限公司），CRP、IL-6、TNF-α试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），LDH、CK-MB检测试剂盒（南京建成科技有限公司），HE 染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司），Western blot 试剂盒（武汉三鹰有限公司），全自动生化仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），酶标仪（深圳市汇松科技发展有限公司），光学显微镜（日本奥林巴斯公司），凝胶成像系统（广州市科之蓝仪器公司）。

1.3 降糖舒心方浸膏制备取人参10 g、麦冬12 g、五味子10 g、黄芪18 g、生地15 g、山药15 g、山茱萸10 g、大黄5 g、黄连8 g、丹参12 g，浸泡半小时，煎煮1.5h，将浓缩药液转移至烘干箱中，90 ℃烘干36 h，制成浸膏，每1 g 相当于原生药10 g，灭菌后保鲜膜密封放入-20 ℃冰箱保存。

1.4 实验动物分组、DHF 模型制备及降糖舒心方混悬液灌胃方法将50 只SD 大鼠随机分为5 组各10 只，低剂量组、高剂量组、西药组、模型组制备DHF模型，对照组不制备DHF模型。DHF模型制备方法：低剂量组、高剂量组、西药组、模型组一次性腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg，72 h 后检测大鼠空腹血糖值，连续两次FBG≥16.7 mmol/L 表明DM 大鼠造模成功。随后DM 大鼠禁食12 h，不禁水。HF 的制模方法参照文献［5］，腹腔注射8%戊巴比妥钠2 mL/kg，麻醉DM 大鼠，打开腹腔，暴露腹主动脉，在腹主动脉上放置7 号针，用手术线结扎腹主动脉和7 号针，然后将7 号针拔出，缩窄腹主动脉60%～70%，术后进行3 天青霉素腹腔注射抗感染治疗。8周后进行超声检查大鼠左室射血分数（LVEF），LVEF<45%即为DHF模型建立成功。室温下解冻浸膏，将其至于EP管中，加入生理盐水，经涡旋震荡配置成2 mL 混悬液。低剂量组灌胃给予1.0 g/（kg·d）的降糖舒心方混悬液，高剂量组灌胃给予1.5 g/（kg·d）的降糖舒心方混悬液，西药组灌胃给予格列喹酮和贝那普利（二药配成等体积溶液），连续灌胃2个月，高脂饲料喂养；对照组给予普通饲料喂养。

1.5 大鼠FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 检测每组取10 只大鼠，末次给药后，禁食12 h，可饮水，用8%戊巴比妥钠，按照2 mL/kg 麻醉大鼠，用注射器抽取腹主动脉血，4 ℃低温静置后，3 000 r/min 离心15 min，取上清。分装、标记后置于-80 ℃冰箱。采用血糖测试仪检测FBG，全自动生化仪测定血清TG、LDL-C、HDL-C，按照ELISA 试剂盒说明书检测血清CK-MB、LDH、CRP、IL-6、TNF-α。

1.6 大鼠心肌组织病理形态观察采用HE 染色方法。“1.5”中的大鼠取血完成后处死，冰上迅速进行心脏取材，0.9%氯化钠溶液漂洗，洗净血液，滤纸擦干，一部分用于HE 染色，即心肌组织按4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，厚度为4 μm，切片经二甲苯、无水乙醇和95%、80%、70%乙醇依次处理后，经苏木精染液浸染5 min，自来水冲洗约1～2 min，1%HCI 溶液分化10 s，自来水冲洗蓝化10～30 min，伊红浸染2～5 min；再次进行梯度酒精、二甲苯脱水、透明，最后中性树胶封片，每只大鼠取3张切片，每张切片随机选取5 个视野在显微镜下观察；细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维等呈深浅不同的红色。另一部分，用眼科剪剪碎心肌组织，用RIPA 裂解液提取蛋白，定量、分装、标记后置于-80 ℃冰箱，用于蛋白的测定。

1.7 大鼠心肌组织NF-κB p65、IκBα 蛋白检测采用Western blot 法。取“1.6”中的另一部分心肌组织，充分裂解匀浆后，在冰上静置0.5 h，用离心机以12 000 r/min 速度离心15 min，取上清，准备蛋白标准品、配置BCA 工作液进行蛋白含量测定，将50 μg 蛋白样品上样，进行SDS-PAGE 电泳和转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，先于一抗4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次，再进行二抗孵育1～2 h，TBST 清洗3 次，加入ECL 显影液进行显影，以GAPDH 为内参，用Image J 软件分析膜上目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS24.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比较大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比较见表1。

表1 各组FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C水平比较（mmol/L，± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05。

2.2 各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较见表2。

表2 各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比较（± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05。

2.3 各组大鼠血清CK-MB、LDH 水平比较大鼠血清CK-MB、LDH水平比较见表3。

表3 各组大鼠血清CK-MB、LDH水平比较（U/L，± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与西药组比较，cP<0.05。

2.4 各组大鼠心肌组织病理形态比较对照组大鼠心肌组织心肌细胞形态正常，排列整齐，细胞间隙正常，边界清晰，未见明显的炎细胞及纤维化；与对照组比较，模型组大鼠心肌组织损伤严重，心肌细胞排列杂乱无序，细胞肿胀和坏死，间隙模糊，部分可见炎性细胞聚集；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、西药组大鼠心肌损害均不同程度缓解，其中高剂量组大鼠心肌损害程度明显降低，心肌细胞形态较正常，炎症细胞浸润明显减轻，心肌细胞排列较整齐。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态比较（×400）

2.5 各组大鼠心肌组织NF-κB p65、IκBα 蛋白表达比较大鼠心肌组织NF-κB p65、IκBα 蛋白表达比较见表4。

表4 各组大鼠心肌组织NF-κB p65、IκBα蛋白表达比较（± s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

研究［6］表明，DM 会增加患心血管疾病的风险，约为非DM 人群的2.5 倍。HF 是DM 心血管并发症之一，是由多种原因导致心脏结构和（或）功能的异常改变，使心室收缩和（或）舒张功能发生障碍，从而引起的一组复杂临床综合征，代表了大多数心血管疾病的终末阶段，主要表现为呼吸困难、疲劳、和液体潴留（肺淤血、体循环淤血及外周水肿）等［7］。研究［8］发现，DM 引起心肌损害导致HF 的发生其演变过程包括三个阶段，第一阶段无明显临床症状，其特征为代谢信号传导受损和心脏能量利用改变；第二阶段通过临床影像学检查可发现左心室肥厚、心肌纤维化等心肌结构重塑表现，无典型的HF 症状；第三阶段出现收缩功能障碍及明显的心衰症状。目前，临床上用于治疗DHF 的降糖药物如噻唑烷二酮类、磺酰脲类、胰岛素等可降低血糖，但同时可引发和加重HF的发展［9］，由此可知西药干预DHF具有局限性。中医药在中医理论的指导下，具有多方面、多层次的调节作用，因此探索中医药治疗DHF 具有重要意义。

降糖舒心方由黄芪、人参、地黄、麦冬、山茱萸、丹参、大黄、黄连、五味子、山药等中药组成，其中人参、麦冬、五味子是生脉散成分，山药、山茱萸、地黄是左归丸成分，两方皆为补益方剂，具有补肾阴、补心气、滋阴生津的作用；大黄、黄连是泄心汤的主要成分，具有清热解毒的功效，丹参清心除烦、活血化瘀，黄芪健脾补气、益卫固表，全方滋阴益气、活血解毒、扶正祛邪、攻补兼施［10］。DM 状态下，可出现高糖、高脂表现，本次研究发现模型组中FBG、TG、LDL-C 水平升高，HDL-C 水平下降，与DM 的一般表现相符。文献［11-12］报道，CRP、IL-6、TNF-α 炎症因子反应体内炎症水平，其水平增加可诱导并反映DM 大鼠心肌损伤。CK-MB、LDH 是心肌损伤标志物，与心肌损伤呈正相关［13］。

本研究显示，与对照组比较，其余4 组大鼠FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平升高，血清HDL-C 水平下降，心肌组织损伤严重；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、西药组FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌组织损伤减轻；与西药组比较，高剂量组FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌组织损伤减轻。表明降糖舒心方具有改善DHF 大鼠高糖、高脂状态、减轻炎症反应、缓解心肌损害的作用，其中高剂量组的治疗效果优于西药组。

核转录因子NF-κB由两个亚基p50和p65组成，是炎症反应的关键介质，静息状态下IκB 蛋白与二聚体NF-κB 紧密结合，阻止NF-κB 与DNA 结合，使其处于失活状态［14-15］。研究［16］表明，DM 状态下高血糖、高血脂、晚期糖基化终产物、氧化应激、炎症因子等可通过经典途径和非经典途径激活NF-κB信号通路，NF-κB 的激活可诱导内皮功能障碍、心肌纤维化、肥大、细胞凋亡，促进糖尿病心肌病（DCM）的发生。WANG等［17］通过对1型糖尿病（T1DM）小鼠心脏组织进行RNA 测序和KEGG 富集分析，发现NF-κB信号通路在T1DM 模型中表达上调，基于这些结果，利用Western blot 检测小鼠心脏组织中NF-κB P65和IκBα 的蛋白表达，结果标明NF-κB P65 蛋白表达升高，IκBα 蛋白表达下降，抑制NF-κB 信号通路的活化，可减轻炎症反应，减轻DCM 的心脏肥大、纤维化。同样的结果在高脂饲养的2 型糖尿病模型和高糖处理的H9c2 细胞中也得到了证实。张弛等［18］通过体内体外实验亦证实鸢尾素通过抑制NF-κB信号通路的活化，可发挥保护DM 心肌损伤的作用。由此可知，NF-κB 信号通路在DM 心脏病中扮演重要角色。本研究显示，与对照组比较，NF-κB p65 蛋白表达升高，IκBα 蛋白表达下降；与模型组比较，低剂量组、高剂量组、西药组NF-κB p65 蛋白表达下降，IκBα 蛋白表达升高；表明降糖舒心方能够抑制NF-κB 信号通路，进而改善DHF大鼠的心肌损伤。总之，降糖舒心方具有降糖、降脂、减轻炎症反应，改善心肌损伤，对DHF 具有治疗作用，其机制可能为抑制NF-κB信号通路有关。