HPLC-MS 法同时测定北细辛药材中30 种禁用农药残留

杜连云，张慧娥，周蕖，张涛，黄鑫，刘芳鑫，李东飞，王恩鹏※，陈长宝※

[1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.吉林紫鑫药业股份有限公司，吉林 通化 135300；3.国家中药质量检测（北方）中心，吉林 长春 130117]

细辛为马兜铃科植物北细辛[Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.]、汉城细辛（Asarum sieboldii Miq.var.seoulense nakai）或华细辛（Asarum sieboldii Miq.）的干燥根和根茎，前两者又习称“辽细辛”[1]。目前市场上，根据传统经验认为北细辛在这3 种正品细辛中质量最好[2]，逐渐成为市场流通的主流品种。东北三省是北细辛的主产地，其中以辽宁为主，其他地区如山东、陕西、河南及山西等地亦有分布[3,4]。根据文献资料报道，北细辛在镇痛、抗炎、抗菌、止咳、抗氧化、抗抑郁和抑制癌细胞等方面扮演重要角色[5-8]，在治疗感冒、流感、鼻炎或作为局部麻醉剂等方面发挥了重要作用[9]。

近年来，为了提高产量，控制害虫和杂草等的侵害，药材在种植过程中不免存在农药滥用的现象，严重威胁到人们的健康。目前，国内外对于农药残留检测的前处理方法主要有固相萃取（Solid phase extraction SPE）法[10]、基质固相分散萃取法[11]和QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）法等[12]。固相萃取法是近年发展起来一种样品前处理技术，它可以有效的将分析物与干扰组分分离，提高分析物的回收率，操作简单、省时省力、重现性好，因此，广泛应用于农药多残留的实际检测之中[10]。检测方法主要有气相色谱法[13]、液相色谱法[14]、气相色谱质谱（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[15,16]和高效液相色谱质谱（High performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS）法[17,18]。由于近年来科技的发展，GC 和LC 受方法灵敏度和选择性限制，已无法达到目前的检测要求。HPLC-MS 具有高通量的离子传输性能，选择性和抗干扰能力强，可在多反应监测（Multi reaction monitoring,MRM）模式下实现一次进样的同时分析百余种物质，结果准确、重现性好、灵敏度高[19]。本文将固相萃取法结合HPLC-MS法同时检测北细辛药材中30 种禁用农药残留，该方法重复性良好、操作简便快捷且特异性强，可运用到北细辛及其他药材中的多农药残留安全检测与质量控制之中。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1290-6470 HPLC-MS型高效液相色谱质谱联用仪（配有ESI 源和Mass Hunter 定量处理软件，美国安捷伦公司）；TD5A-WS 型离心机（湖南湘仪公司）；MilliQ 型超纯水器（美国Millipore 公司）；赛多利斯BSA224S-CW 型电子天平（德国赛多利斯公司）；N-1300 型旋转蒸发仪（日本EYELA 公司）。

乙腈（色谱纯），购自美国赛默飞世尔公司；农药残留净化包、农药残留净化管购自北京迪马科技有限公司。

北细辛样品：来源于吉林省和辽宁省不同产地的33 批抽检样品，见表1；30 种禁用农药混标（批号：D6850065，上海安谱实验科技股份有限公司），见表2。

表1 33 批北细辛的来源及批号Table 1 Source and batch number of 33 batches of

表1 33 批北细辛的来源及批号Table 1 Source and batch number of 33 batches of

表2 MRM 模式的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of MRM mode

1.2 供试品制备

用粉碎机将北细辛样品粉碎成粉末，过3 号筛，置于干燥处备用。经过前期对5 种方法[详见中国药典（2020 版）第四部通则]考察优选后[20]，结果发现直接提取-固相萃取法方法回收率最好，故最终采用直接提取-固相萃取法对北细辛药材中的禁用农药进行提取。

提取-净化：参考中国药典（2020版）第四部“2341农药残留量测定法”第五法药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法。

1.3 标准工作溶液的配置

1.3.1 混合对照品溶液的制备 精密量取1.0 mL 禁用农药的混合对照品溶液（100g/mL），转移至20 mL容量瓶中，乙腈进行稀释处理至目标刻度线，摇匀后即得5g/mL 的混合对照品溶液。

1.3.2 空白基质溶液的制备 该过程的处理方法与制备供试液时方法相同。取空白基质样品，参照供试液的制备，处理后即得到空白基质溶液。

1.3.3 基质混合对照溶液的制备 分别精密量取1.0 mL 空白基质溶液，置氮吹仪上，40 ℃水浴浓缩至约0.6 mL，然后分别加入混合对照品溶液4L、10L、20L、40L、80L 和100L，并用乙腈进行稀释处理至1 mL 刻度线，涡旋混匀后即得0.02g/mL、0.05g/mL、0.10g/mL、0.20g/mL、0.40g/mL 和0.50g/mL 的基质混合对照品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm 100 mm，1.8m）；柱温：40 ℃；样品室温度：4 ℃；流速：0.25mL/min；流动相：A 为0.1%甲酸5mmoL 甲酸铵水溶液，B为乙腈；进样体积：2L；梯度洗脱:0～4min，10%～49%B，4～15 min，49%～60% B，15～20 min，60%～80% B，20～20.1 min，80%～95% B，20.1～25 min，95%B，25～25.1 min，95%～10%B，25.1～30 min，10%B。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI），干燥气温度：250 ℃；干燥气流量7 L/min；雾化器压力：30 psi；鞘气温度：325 ℃；鞘气流量：11 L/min；毛细管电压：3 500 V；模式：MRM 扫描。

2 结果与分析

2.1 基质效应

细辛药材中基质较为复杂，含有多糖类物质和色素，在农药残留检测时，会产生基质效应，如不去除，目标色谱峰被干扰，难以对目标农药进行准确定性和定量。通常的解决办法有用空白基质配制标准曲线、稀释法和加入保护剂法。对北细辛进行前处理时，在待净化的乙腈样品直接提取液中，使用无水硫酸镁进一步除水，加入PSA 可去除有机酸、糖类和色素等，加入C18吸附非极性物质，另外还可以去除脂质。为了增加试验准确度及尽可能降低基质效应的影响，本方法采用空白基质配制标准曲线进行校准。

2.2 质谱条件优化

通过直接进样方式，优化30 种待测农药的混合对照品溶液的质谱参数。首先对待测农药混标分别进行正离子模式和负离子模式一级质谱全扫描，结果发现，正离子模式扫描的峰丰度高于负离子模式，所以选择正离子为本方法的扫描模式。在确定母离子后，以正离子模式进行二级质谱扫描，以丰度最强、次强的碎片分别作为定量、定性离子。在正离子MRM 模式下对质谱参数进行优化，得到的质谱条件，见表2。

2.3 线性关系

以1.3 项下各基质标准液制备标准曲线，将待测物离子的峰面积作为纵坐标，将标准工作液的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3。30 种禁用农药线性关系良好，相关系数R2≥0.99，根据表3 所示，线性范围内线性关系较好，以仪器能检出基质混合对照品溶液并能定量的最低量得出方法的检出限（Limits of detection,LODs）为0.004～ 0.020 mg/kg，定量限（Limits of quantification,LOQs）以中国药典（2020 版）第一部“0212 药材和饮片检定通则”项下药材及饮片（植物类）禁用农药定量限值规定为参照，为0.010～0.200 mg/kg。

表3 30 种禁用农药残留的线性关系、检出限及定量限Table 3 Linear relationships,the limits of detection and the limits of quantification of 30 kinds of banned pesticides

2.4 回收率

在北细辛空白样品中加入3 个水平（低、中和高）的混合标准溶液，按1.2 项下北细辛样品前处理方法，检测样品的加标回收率（n=6），结果见表4。由表4 试验数据可知，细辛中30 种禁用农药的平均回收率为81.35%～104.35%，相对标准偏差（Relative standard deviations,RSD）在2.1%～7.6%，符合中国药典（2020 版）第四部“2341 禁用农药残留”回收率的相关规定。

表4 30 种禁用农药残留的平均回收率结果Table 4 Results of the average recoveries of 30 kinds of banned pesticide residues

2.5 实际样品分析

按照中国药典（2020 版）第一部“0212 药材和饮片检定通则”项下规定药材及饮片（植物类）禁用农药不得检出（不得过定量限）所述方法，对本文中涉及的33 批北细辛药材样品进行的检测，结果在33 批北细辛药材均未检出30 种禁用农药残留。

3 讨论

以植物为原料的中药材在中国由来已久，但是其有毒有害残留物已经影响了药物的疗效和安全。本研究采用直接提取法结合固相萃取法对北细辛样品进行快速前处理及净化，使用HPLC-MS 法建立了北细辛药材中甲胺磷、苯线磷及苯线磷砜等30 种禁用农药残留量的测定方法。试验结果表明，液相色谱和质谱的串联能够避免杂质的干扰，尤其是对于含有复杂成分的北细辛样品，能有效地吸附和去除杂质，避免产生交叉污染，减少假阳性的检出率，在互相不干扰的情况下使每个目标检测物能充分的分离和出峰，并展现出美观的峰形，便于后续定量，同时能提高分析的选择性和检测灵敏度，可达到检测浓度较低及准确定量的目的。因此，本方法适用于北细辛样品中30 种禁用农药的分析检测，对北细辛药材的质量安全控制提供了禁用农药监测的有力借鉴和技术保障。