多重核酸检测系统同时检测22种呼吸道病原体的应用效果研究*

徐 亮,邱灿林,徐子强,邓俊兴,丰建国,曾 鑫,王衍芬

(韶关市疾病预防控制中心,广东 韶关 512000)

急性呼吸道感染是婴幼儿的常见和多发病,发病率高,给婴幼儿造成不同程度的健康威胁。国内外研究显示,病毒感染是急性呼吸道感染的主要致病源之一[1-4]。因此,研究韶关市不同年龄儿童在不同季节常见呼吸道病毒病原及其流行病学特点,将有助于提高儿童急性呼吸道感染病毒病原监测能力,对诊断和预防起到关键作用。本研究选取3个监测点,对韶关市儿童急性呼吸道病毒感染情况进行分析,结果如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 2020年8月至2021年7月从粤北人民医院采集符合病例定义的886份患儿咽拭子,同时收集姓名、年龄、发病日期、采样日期及临床症状等信息。病例定义及标本采集详见参考文献[5]。

1.2方法

1.2.1标本采集 于2020年8月至2021年7月对符合病例定义的886例患儿进行采样,采集发病时间在1～3 d内的咽拭子,放置于病毒保存液中,0～4 ℃低温保存,尽快送往实验室,提取核酸后置于-80 ℃下备用。

1.2.2仪器及试剂 ABI7500PCR扩增仪,Auto-Pure32A全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司),核酸提取试剂盒(磁珠法,中元汇吉),实时定量PCR检测试剂盒AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit(美国AB公司),各型病毒的引物和探针由日本TaKaRa公司合成。多病原检测采用HOPE ONE检测仪进行检测。

1.2.3核酸提取及荧光定量PCR 根据试剂盒说明书,提取病毒总核酸,然后对提取的核酸在同一反应条件下同时进行9种病原体的扩增,每种病原体为1个反应孔。反应条件:50 ℃ 30 min;95 ℃ 15 min;95 ℃ 15 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,5个循环;95 ℃ 15 s,55 ℃ 60 s,40个循环;55 ℃收集荧光信号。实验中使用核糖核蛋白(RNP)为内对照。采用多重核酸检测系统同时定性检测22种呼吸道病原体,包括16种RNA病毒、2种DNA病毒及4种细菌:甲型流感病毒、乙型流感病毒,甲型流感病毒H1N1、呼吸道合胞病毒A型和B型、副流感病毒-1/-2/-3/-4、冠状病毒OC43/229E/HKU1/NL63、肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团杆菌、百日咳鲍特菌、鼻病毒、肠病毒、人偏肺病毒、腺病毒和博卡病毒。

1.3统计学处理 应用Excel2003进行数据汇总处理,应用SPSS22.0统计软件进行数据分析,计数资料以率表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1呼吸道病毒检出情况 一共检测886份标本,阳性425例,总检出率为47.97%(425/886)。9种呼吸道病毒均有检出,其中FluA检出率最高,为15.46%(137/886),其后依次为HRV、HPIV、FluB、RSV、ADV、MPV、HCoV、HBoV。见表1。

表1 呼吸道病毒病原谱及检出情况

2.2呼吸道病毒的流行特征

2.2.1不同季节病毒分布情况 FluA在冬季的检出率最高;HRV的检出高峰主要在秋季;HPIV的高峰在春季。春季检出率最高为FluA、其次为HPIV、FluB和RSV;夏季依次为FluA、HRV、HPIV和FluB;秋季为HRV、HPIV、FluA;冬季以FluA最高,其后为HRV和MPV。见表2。

表2 呼吸道病毒在不同季节的分布情况[n(%)]

2.2.2不同年龄病毒分布情况 在886例患儿中年龄最小者为1.8个月,最大者为13岁。各种病毒在不同年龄段检出率分布见表3。0～<1岁组病毒检出以FluA、HRV为主;1～<3岁组以HRV、FluA为主;3～<6岁组和≥6岁组都以FluA为主。除ADV和HBoV外及其他病毒在各年龄段检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 呼吸道病毒在不同年龄的分布情况[n(%)]

2.3呼吸道病毒混合感染 在886份标本中,同时检出2种以上呼吸道病毒混合感染43份,检出率为4.85%(43/886)。9种呼吸道病毒都存在混合感染的情况,以HRV和其他呼吸道病毒合并感染为主。

3 讨 论

呼吸道感染的病毒病原学因地域、年份、季节和年龄等的不同而有差异[6]。据报道,呼吸道病毒检出率均超过20%(21.6%～58.2%),RSV、HPIV、ADV 和Flu是最常见的呼吸道感染病毒病原[7-10]。通过对韶关市886 例急性呼吸道感染患儿咽拭子的病毒病原学检测,共检出9种呼吸道病毒,阳性425例,总检出率为47.97%,FluA是2019年儿童急性呼吸道感染首位病毒病原,其后是HRV和HPIV,3种病毒病原占总检出数的65.65%。本研究病例中呼吸道病毒检出率与何英等[10]报道深圳市检出率(48.0%)的结果一致,略低于韶关市前几年的检出率(51.36%)[11],而高于以往北京(32.0%)、上海(32.09%)等地区的报道[12-13]。

儿童急性呼吸道病毒感染全年均可发病,而且不同季节病毒主要感染类型也有所不同。本研究发现,2019年不同季节FluA、HRV、HPIV、FluB、RSV和MPV的检出率均有差异,其中FluA和MPV的发病高峰在冬季;HRV的高峰在秋季;而HPIV、FluB和RSV主要集中在春季,ADV、HCoV和HBoV发病季节特征不明显。提示不同季节的就诊患儿应有针对性地关注不同呼吸道病毒病原体的感染[14-16]。

本研究发现,不同年龄组患儿的呼吸道病毒病原体检出率存在差异,3～<6岁组患儿9种病毒病原体检出率最高,0～<1岁组患儿检出率最低。0～<1、3～<6岁和≥6岁组患儿的FluA检出率最高,1～<3岁组的HRV检出率最高,与国内文献报道基本相符。3～<6岁组儿童日常主要在托幼机构聚集活动,近距离飞沫传染的概率大,伴随着年龄增长,活动能力逐步增强,活动范围也不断扩大,从而接触呼吸道病原体的概率也较高,但是其自身免疫功能还在逐步完善,抵抗力相对较弱,这与病毒感染有关。0～<1岁组婴儿大部分以母乳喂养为主,母乳中的免疫球蛋白含量较高,所以自身对病原体有一定的抵抗力;且婴儿接触外界的概率较低,主要是家庭小范围活动,因而接触病原体的机会也相对较少。

本研究通过实时荧光RT-PCR检测呼吸道病毒病原体的方法得出儿童呼吸道病毒病原分布情况及其流行特点,这与韶关市长期流行特点是否一致需要进行进一步的研究,不同地区、时间、温湿度、气候条件、病原体的感染及其流行情况存在较大差异。韶关市急性呼吸道感染患儿病毒检出率相对于国内其他地区而言处在中上位置。究其原因可能是:首先,与儿童自身的生长发育特点有关;其次,与韶关市所处的地理位置、气候环境等相关,因此应继续对更多可能影响因素进行深入研究,这样才能制定符合韶关市有效的儿童急性呼吸道感染疾病诊断、治疗和防控措施。