ICU住院患者万古霉素耐药屎肠球菌患病率和分子流行病学调查研究

邓雅文 张智贤 陈百计 段朝晖 谢晓英

万古霉素耐药屎肠球菌（VREfm）是医院获得性感染和疾病控制和预防中心重点监控的病原菌，约占卫生保健相关肠球菌感染的三分之一［1］。VREfm 在中国的患病率相对较低。近两年全国耐万古霉素屎肠球菌（VREfm）发病率从2.2%升至3.2%（http：//www.chinets.com/），我院数据亦从13.3%升至26.4%（http：//www.carss.cn/），由此可见我院的VREfm 发病率近两年快速上升且显著高于全国平均水平，这对医院耐药菌感染控制带来了很大挑战。通常多重耐药菌在ICU 被检出的比例比其他科室高，然而目前还缺乏我院VREfm 的流行病学数据。在本研究中，我们选择ICU 进行了一项单中心研究，以评估我院ICU 中VREfm 的流行传播情况。

1 临床资料

1.1 一般资料2022 年6 月至2023 年7 月从ICU患者细菌培养标本中分离的21 株VREfm 纳入研究，同一个患者选第一次符合条件的菌株。标准菌株屎肠球菌ATCC29212 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。本研究经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准（SYSKY-2023-469-01）。根据国家立法和制度要求，本研究不需要受试者法定监护人/近亲属的书面知情同意。从医院电子病历系统收集的患者年龄、性别、Charlson评分、合并症、住院时间、标本类型。ICU 科室含普通ICU、急诊ICU（EICU）、心血管内科ICU（CCU）、心血外科ICU、神经科ICU、儿科ICU（PICU）。

1.2 方法（1）VREfm 鉴定和药敏实验全部菌株复苏后经Vitek MS 质谱仪进行重新鉴定，药敏试验采用Vitek2 全自动微生物分析仪的GP67 卡以及手工KB 法（替考拉宁）进行检测，药敏结果参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2023 年标准进行判断，替加环素采用欧洲抗微生物药敏试验委员会（EUCAST）标准。（2）分子流行病学选取耐药基因vanA、vanB、vanD、vanM 进行PCR 扩增和凝胶电泳，对阳性基因送测序并在PUBMED 进行确认。屎肠球菌7 个管家基因（atpA、ddI、gdh、purK、gyd、pstS、adk）的引物序列和反应条件参考MLST网站（https：//pubmlst.org/）。所有PCR 产物进行双向测序，并通过MLST 数据库（http：//efaecium.mlst.net）进行序列型（sequence type，ST）比对分析。用Mega11 分析软件构建最小生成树分析各菌株之间的亲缘关系。

1.3 统计方法对于单个患者的人口学和临床特征，分类变量用数字和百分比进行汇总，连续变量用（±s）进行描述。所有数据均使用SPSS 23.0软件进行分析。采用Mega11 软件对不同背景下的相关STs 采用BURST 算法进行最小生成树（MLST）分析。

2 结 果

2.1 VREfm 在ICU 的流行情况我院ICU 患者VREfm 患病率在2022 年下半年和2023 年上半年分别为12.12%和33.33%。VREfm 阳性患者年龄（65± 15）岁，最常见的标本类型为尿液和血液（n=5；23.81%），普通ICU 的患者携带VREfm 的比例最高（n=10；47.62%），脑血管疾病和糖尿病是常见的并存病（n=7；33.33%），见表1。PCR 结果显示，21株实验菌株均检出vanA 基因。见表2。

表1 2022 年-2023 年ICU 感染VREfm 患者的人口学特征及临床特征

表2 21 株VREfm 分子流行病学及抗生素耐药谱

2.2 抗菌药物敏感性21 株菌均经Vitek MS 质谱仪重新鉴定确认且均表现出多重耐药。菌株耐药率分别为：万古霉素（100%）、利奈唑胺（0%）、替加 环 素（9.52%）、青 霉 素（100%）、四 环 素（90.48%）、氨苄西林（100%）、红霉素（76.19%）、左氧氟沙星（100%）、环丙沙星（95.24%）、呋喃妥因（85.71%）、替考拉宁（100%）。见表2。

2.3 分离株的遗传分布利用7 位点MLST 将所有VREfm 菌株分为3 个STs，且均为CC17 克隆群。21株菌株中优势STs为ST80（n=16，76.19%），其次是ST78（n=3，14.29%）和ST2460（n=2，9.52%）。2022 年下半年分离的VREfm 的STs 均为ST80，在2023 年出现了其他STs 菌株的流行。见表2。进化树结果提示三种STs 有相同的起源，但亲缘关系较远，相同STs菌株内部亲缘关系较近。见图1。

图1 21 株VREfm MLST 方法聚类图

3 讨 论

近几十年来，VREfm 在ICU 的定植或感染率从13.01%到34.25%不等［2］，北京某大型教学三甲医院ICU 患者定植比例也达31.1%［3］。本研究中，我院VREfm 检出率高于全国平均水平，且患者呈现年龄大、病情重、合并疾病多等特点，为VRE 的传播提供了有利条件。肠球菌的糖肽耐药是由van 基因簇介导的，其中vanA 和vanB 基因在世界范围内报道最多。vanM 基因在2006 年在我国首次被发现，目前流行于北京、上海和杭州等城市，但在本研究中未发现该基因的存在，这表明广州地区的VREfm 与其他大型发达城市有差异。

携带vanA 抗性基因的菌株对万古霉素和替考拉宁都具有高水平的耐药性，称为vanA 表型［4，5］，本研究中VRE 基因型与耐药表型一致。三种不同基因型耐药性有区别，ST2460 菌株对TGC 和高水平链霉素耐药，属于高耐药菌株，而ST78 菌株对呋喃妥因和四环素敏感，其抗生素耐药性没有其他两个型别的严重。由此可见分子流行病学研究对VREfm 的防治有重要的意义，临床需重视高耐药菌株的流行且要根据药敏结果选用抗生素，提高抗菌效果。

我院ICU 优势STs 是ST80，但因菌株数量少尚不能判断是否有ST80 基因型VREfm 的爆发。ST80 是国外医院中比较常见的STs［6］，国内近两年才可查到深圳有该型别的流行［7］。广州和深圳经济和人员往来频繁，由此推测ST80 可能存在相邻城市间传播流行，这与北京、杭州等城市的VREfm 流行情况有差异，因此我国南方地区在控制VREfm 的传播流行和治疗上需要寻找更有针对性的对策。我院ICU 分离的VREfm 均属于克隆复合体（CC）17，这个复合群是医院内传播的主要克隆群［8］，这与国内外相关文献描述的一致。MLST 聚类分析结果提示可能存在同一医院的同一病房或不同病房之间循环克隆传播，必须予以高度关注。

我们的研究分析了近两年ICU 住院患者VREfm 的携带/感染情况，发现了国内较少见的ST80 型别VREfm 的流行，为研究整个南方地区VREfm 流行和防控提供重要参考。