紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鉴定

刘 佳,王少鹏,史 昆,周 仂,王 赞

(中国农业大学草业科学与技术学院,北京 100193)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上广泛种植的重要豆科牧草之一。在我国,紫花苜蓿广泛种植于东北、华北和西北等干旱、半干旱地区,其产业发展严重受到干旱环境的制约。因此挖掘紫花苜蓿抗旱相关的基因资源,探索紫花苜蓿抗旱基因在干旱胁迫应答过程中的功能,对紫花苜蓿的遗传改良具有重要作用。

转录因子是植物响应生物和非生物胁迫调控机制中的重要调节因子[1-2]。MYB转录因子家族是成员数量最多、参与生物学过程最广泛的转录因子家族之一,在植物生长发育及胁迫应答中均发挥着重要作用[3-4],广泛参与植物次生细胞壁的形成。例如,AtMYB58参与在SND1介导的次生细胞壁合成的转录调控网络中,主要通过特异性激活木质素生物合成基因的转录,调控次生壁的形成[5];AtMYB58的同源基因EjMYB1在枇杷(Eriobotryajaponica)果实贮藏期间调节木质素的生物合成[6];在水稻(Oryzasativa)和柳枝稷(Panicumvirgatum)中也有报道MYB58参与次生壁的合成[7-8]。植物次生细胞壁显著影响植物对胁迫的耐受性[9]。例如,过表达白桦(Betulaplatyphylla)BplMYB46可以促进木质素的沉积,提高转基因白桦对盐胁迫和渗透胁迫的耐受性,表明转基因白桦的非生物胁迫反应和木质素的生物合成途径可能是相互交叉的[10];Ji等发现拟南芥AtTCF1基因通过调节木质素的生物合成来调控抗冻性[11]。目前,关于MYB58的研究主要围绕其调控次生细胞壁形成的机制,其参与植物抗逆性的研究较少,因此有必要对紫花苜蓿MsMYB58基因进行抗逆性相关研究。

本研究克隆了MsMYB58基因,在生物信息学的基础上分析该基因在紫花苜蓿不同组织器官以及不同逆境胁迫下的表达模式,确定MsMYB58蛋白的亚细胞定位,并分析MsMYB58异源表达转基因烟草的抗旱表型,初步分析该基因在紫花苜蓿抗旱性中的功能。研究结果为进一步深入研究MsMYB58响应紫花苜蓿胁迫的分子机制提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料为‘中苜1号’(‘Zhongmu No.1’)紫花苜蓿和本氏烟草(N.benthamiana),均由中国农业大学草业科学与技术学院牧草基因资源与遗传改良实验室保存并提供。2022年8月试验所用材料均播种于苗钵中,生长待用。

1.2 基因的克隆及生物信息学分析

以紫花苜蓿的cDNA为模板,根据特异性引物MsMYB58-F/R进行PCR扩增,获得MsMYB58全长。利用NCBI网站对MsMYB58蛋白质的理化特性进行分析。采用SOPMA二级结构预测分析软件预测了MsMYB58蛋白质的二级结构。用MEGA7软件使用邻接法将MsMYB58蛋白与其他物种的MYB58蛋白进化树分析。

1.3 亚细胞定位

根据基因序列设计带有酶切位点PACI和ASCI的MsMYB58-GFP引物,进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMDC83上,挑取单克隆通过菌落PCR鉴定后测序,将测序正确的质粒利用基因枪轰击洋葱表皮细胞[12],使用激光共聚焦显微镜(Nikon A1R HD25,日本)进行观察,确认荧光蛋白表达的位置。

1.4 组织特异性及不同胁迫处理下表达模式分析

对紫花苜蓿不同组织(根、茎、叶、花)进行取样。将紫花苜蓿幼苗分别放置在200 mmol·L-1NaCl溶液(0,2,4,8,12,24 h)、100 μmol·L-1脱落酸(Abscisic acid,ABA)溶液(0,2,4,8,12,24 h),以及自然干旱(0,4,8,12,16,18 d)处理下,分别在对应时间点进行取样,样品保存在-80℃。以紫花苜蓿MsActin-qPCR-F/R作为内参基因(表1),应用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒进行qPCR,采用2-ΔΔct[13]的算法计算表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer list

1.5 转基因烟草的获得及抗旱性分析

通过全式金同源重组试剂盒pEASY®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit,以pBI121-MsMYB58-F/R为引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到超表达pBI121载体上,通过测序获得正确的重组质粒。采用冻融法[14]将35S∶∶MsMYB58-GUS重组质粒转入农杆菌GV3101,通过菌落PCR验证后,-80℃保存。采用农杆菌转化的叶盘法将重组质粒转入烟草[15],获得转基因材料并在DNA和RNA水平上鉴定阳性植株。在同一生长环境下,待WT和转基因材料生长1个月后,开始进行干旱处理,处理18 d后进行表型拍照,并测定叶绿素荧光参数,收集样品测定过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛和脯氨酸含量。对干旱处理后的植株进行复水一周的处理,并拍照记录表型,每组处理共3个生物学重复。过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均采用可见分光光度法[16]进行测定。丙二醛和脯氨酸含量分别采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)比色法[17]和茚三酮比色法[18]进行检测。叶绿素荧光参数[光系统Ⅱ(PSⅡ)利用效率(Quantum yield of photosystem II,Phi2),非光化学猝灭(Non-photochemical quenching,NPQt),光系统Ⅱ最大光化学量子产量(Maximum efficiency of photosystem II,Fv/Fm)]由便携式叶绿素荧光仪MultispeQ(Photosynq,美国)进行测定。

1.6 数据处理

分别采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8对数据进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 MsMYB58克隆与生物信息学分析

本研究以‘中苜1号’紫花苜蓿基因组[20]为参考基因组,克隆得到了MsMYB58基因,通过测序确定了其序列(1 002 bp,图1A)。通过对MsMYB58蛋白进行理化分析发现,MsMYB58编码333个氨基酸,分子量是37.80 kDa,理论等电点是4.75。通过对MsMYB58蛋白进行二级结构预测分析,结果表明该蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,占总体的51.95%,α-螺旋占30.63%,β转角占6.31%,延伸链占11.11%(图1B)。MsMYB58氨基酸序列具有植物MYB转录因子家族的特异性结构域SANT-myb DNA结合结构域,属于R2R3-MYB亚家族(图1C)。

图1 MsMYB58的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of MsMYB58注:A,MsMYB58的克隆;B,MsMYB58蛋白质二级结构的预测;C为MsMYB58保守结构域分析Note:A,cloning of MsMYB58;B,prediction of MsMYB58 protein secondary structure;C,conserved domain analysis of MsMYB58

将MsMYB58与蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) MtMYB63(XP_013464259.1)、红三叶(Trifoliumpratense) TpMYB10(XP_045799731.1)、鹰嘴豆(Cicerarietinum) CaMYB63(XP_004488797.1)、狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius) LaMYB308(XP_019443727.1)、赤小豆(Vignaumbellata) VuMYB7(XP_047180024.1)、大豆(Glycinemax) GmMYB63(XP_006598214.2)、野大豆(Glycinesoja) GsMYb63(XP_028203131.1)、落花生(Arachishypogaea) AhMYB58(XP_025674104.1)、毛果杨(Populustrichocarpa) PtMYB58(XP_002310679.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana) AtMYB58(NP_173098.1)、小麦(Triticumaestivum) TaMYB58(XP_044441013.1)、玉米(Zeamays) ZmMYB58(XP_020401111.1)、粳稻(Oryzasativasubsp.Japonica) OsMYB58(XP_015634881.2)共13个物种的MYB蛋白进行系统发育树的构建。系统发育树分析表明,MsMYB58与蒺藜苜蓿、红三叶、鹰嘴豆等豆科的同源蛋白的亲缘关系较近,与粳稻OsMYB58亲缘性关系较远(图2)。

图2 MsMYB58蛋白的系统进化树构建Fig.2 Phylogenetic tree analysis of MsMYB58 proteins

2.2 MsMYB58亚细胞定位

构建了35S∶∶MsMYB58-GFP的载体,转化洋葱表皮细胞后,通过激光共聚焦显微镜进行观察。结果显示,当空载转化洋葱表皮细胞后,细胞内均可以观察到绿色荧光的出现,而轰击表达载体35S::MsMYB58-GFP的洋葱表皮细胞在细胞核、细胞壁和细胞膜中均观察到绿色荧光(图3),因此MsMYB58定位在细胞核、细胞壁和细胞膜中,但具体机制需进一步研究。

图3 MsMYB58的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of MsMYB58注:图中白色箭头代表细胞核的位置,黄色箭头代表细胞膜的位置,红色箭头代表细胞壁的位置Note:The white arrows in the figure represent the location of the nucleus,the yellow arrows represent the location of the cell membrane,and the red arrows represent the location of the cell wall

2.3 紫花苜蓿MsMYB58的表达分析

采用qRT-PCR技术分析MsMYB58在紫花苜蓿中的组织特异性。结果表明,MsMYB58在紫花苜蓿的根、茎、叶和花中均有不同程度的表达,其中在茎中表达量最高,其次是叶和花,根中的表达量最少(图4)。

对紫花苜蓿幼苗进行ABA,NaCl以及自然干旱处理,检测了不同处理时间下MsMYB58的表达量。结果表明,在ABA处理下,MsMYB58的表达量呈现先上升后下降的变化趋势,在12 h表达量最高,为对照的25倍(图4B);NaCl处理24 h时表达量达到最高水平,为对照的26倍(图4C)。MsMYB58的表达量随着自然干旱处理时间的递增呈现先升高后降低的趋势,在16 d时其表达量达到最高,在18 d时虽有下降但仍显著高于0 d(图4D)。以上结果表明,MsMYB58在紫花苜蓿响应非生物胁迫中具有重要作用。

2.4 异源超表达MsMYB58烟草的抗旱性

通过DNA(图5A)和RNA水平(图5C)的检测,选取其中3个相对表达量高的转基因株系(OE-1,OE-2和OE-3)进行后续的干旱处理。结果表明,干旱胁迫18 d后,WT植株叶片的萎蔫程度比转基因株系更严重;复水1周后,转基因株系的叶片恢复正常,但野生型没有恢复(图5B)。试验结果说明超表达MsMYB58增强了转基因烟草的抗旱性。

图5 过表达MsMYB58提高了转基因烟草的抗旱性Fig.5 Overexpression of MsMYB58 improved drought resistance of transgenic tobacco注:A为转基因株系DNA水平的验证;M为DNA分子量标准DNA,+表示阳性对照;B为干旱胁迫下过表达MsMYB58转基因株系的表型;C为转基因株系中MsMYB58相对表达量,*表示不同株系的表达量与WT相比差异显著(P<0.05)Note:A,verification of DNA levels of transgenic lines;M,DNA marker;+,positive control;B,phenotypes of transgenic lines overexpression MsMYB58 under drought stress;C,the relative expression of MsMYB58 in transgenic lines,* indicates significant differences in expression in different tissues compared to WT (P<0.05)

2.5 MsMYB58转基因烟草在干旱胁迫下的生理与光合响应

植物在干旱胁迫过程中通过提高过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的酶活来抵制活性氧带来的伤害[16]。正常情况下,与WT相比过表达株系的过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的酶活性无显著差异。在干旱胁迫下,转基因烟草的过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶均显著高于WT(图6A-C)。丙二醛含量的变化趋势则相反,干旱胁迫下过表达株系的丙二醛含量显著低于WT,而脯氨酸含量的变化与过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶酶活性的变化趋势相同(图6D-E)。近年来,叶绿素荧光参数作为常用指标来反映胁迫条件下植物光合生理作用的特性[21]。正常情况下,与WT相比,过表达株系的Phi2,NPQt和Fv/Fm均无显著性差异。在干旱胁迫下,转基因株系的Phi2和Fv/Fm均显著高于WT,而NPQt则相反(图6F-H)。以上结果表明在干旱胁迫下,过表达株系通过提高光合作用能力和抗氧化能力来增强其抗旱性。

图6 WT与异源超表达MsMYB58转基因植株的抗性生理指标与叶绿素荧光参数Fig.6 Physiological index of resistance and chlorophyll fluorescence parameters of transgenic plants with WT and heterogeneously overexpressing MsMYB58注:*表示处理之间差异显著(P<0.05)Note:* indicates significant differences between treatments (P<0.05)

3 讨论

植物中大多数MYB转录因子属于R2R3-MYB亚家族[22-23]。R2R3-MYB亚家族在植物响应逆境胁迫的调控中具有重要的作用。近年来有大量关于R2R3-MYB亚家族参与植物非生物胁迫的报道,如拟南芥、小麦、烟草、水稻和大豆的相关报道中分别鉴定出了137个、393个、174个、95个和288个R2R3-MYB亚家族基因,其中部分已被证明参与响应干旱、盐碱及高温等非生物胁迫[24-29]。本研究通过克隆获得了MsMYB58,其氨基酸序列具有植物MYB转录因子家族的特异性结构域SANT-MYB的DNA结合结构域,属于R2R3-MYB亚家族(图1C),并且其表达受干旱胁迫、NaCl和ABA处理的诱导。绝大多数转录因子只在细胞核中定位和发挥作用。然而,在某些条件下,一些转录因子也可以定位于细胞膜中。例如,SiMYb42,属于R2R3-MYB亚族,其亚细胞定位在细胞核与细胞膜上,推测是由于细胞膜上的SiMYB42蛋白在经过某些蛋白修饰后,进入细胞核中行使其功能[30]。辣椒中转录因子WRKY30的亚细胞定位同样在细胞核及细胞膜上[31]。本研究也发现MsMYB58定位于细胞核、细胞膜和细胞壁中,这表明MsMYB58可能存在某些转录后修饰,使其亚细胞定位发生了转移,但具体的机制需要进一步研究。

干旱是限制紫花苜蓿产量和品质的主要因素之一,因此有研究学者通过基因工程技术提高紫花苜蓿对干旱胁迫的耐受性,来增加紫花苜蓿的产量。例如,MsHSP70在紫花苜蓿中受到高温胁迫、ABA和过氧化氢胁迫的诱导,转入拟南芥后增强了植株对PEG和ABA胁迫的耐受性[32]。MsNTF2L通过促进活性氧清除、降低气孔密度、ABA诱导气孔关闭和表皮蜡质积累来增强紫花苜蓿的抗旱性[33]。Ma等[34]发现超表达MsTMT的转基因紫花苜蓿中α-生育酚和总生育酚水平显著高于对照,转基因紫花苜蓿的抗旱性显著提高。干旱胁迫下,在拟南芥中过表达MsMYB2L促进了脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的合成,从而提高了转基因拟南芥的抗旱性[35]。本研究中发现MsMYB58显著受干旱胁迫的诱导,并且超表达MsMYB58可以适当提高烟草对干旱胁迫的耐受性。

在逆境条件下,植物会产生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),这些活性氧分子对植物的生长发育产生负面影响[36]。本研究发现,ABA处理可以显著诱导MsMYB58表达,且超表达MsMYB58可以显著增加转基因烟草在干旱胁迫下过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性以及脯氨酸的含量。ABA作为胁迫信号在调节植物的干旱反应中具有重要作用,Wang等[18]研究发现黄瓜(Cucumissativus)中CsATAF1通过上调ABA应答基因参与ABA信号通路来提高其抗旱性。Zhou等[12]研究发现在烟草中MsNAC51通过调控脯氨酸合成基因MsP5CS和活性氧清除基因MsPOD-P7的表达来增强其抗旱性。因此,干旱胁迫下,MsMYB58可能通过对ABA的响应,激活了相关抗性基因的表达,如过氧化物酶基因、脯氨酸合成酶基因等,通过减少干旱胁迫引起的氧化胁迫,增强植物的抗旱性。

另外,在一些物种中MYB58被报道正调控次生细胞壁的形成。近年来,许多研究都表明次生壁形成可以提高植物的抗逆性。如OsCSLD4是参与调控植物细胞壁糖类合成的基因,而过表达OsCSLD4则显著提高了水稻的耐盐性,表明OsCSLD4不仅参与植物细胞壁的合成而且在响应盐胁迫中也具有重要作用[37]。RL14通过调控水稻中纤维素和木质素的合成,增强水稻的抗旱能力[38]。因此,MsMYB58可能也参与次生细胞壁形成,从而提高抗旱性。MsMYB58参与紫花苜蓿次生细胞壁形成的功能和机制解析,需在紫花苜蓿中进一步研究。

4 结论

紫花苜蓿MsMYB58开放阅读框全长1 002 bp,编码333个氨基酸,在茎中表达量最高;定位于细胞核、细胞膜和细胞壁中;其表达受自然干旱、ABA和NaCl等胁迫的诱导。在烟草中异源超表达MsMYB58增强了干旱胁迫下转基因烟草的光合能力和抗氧化能力,显著提高了转基因烟草的抗旱性。本研究确认了MsMYB58的抗旱功能,为紫花苜蓿抗旱育种提供了潜在的基因资源,具体的抗旱分子机制仍需进一步研究。