基于网络药理学及分子对接技术探讨黄芪多糖干预骨质疏松的作用机制研究

冯 玘

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是骨代谢性异常、骨稳态被破坏导致骨骼功能发生改变的疾病［1-2］.骨质疏松大多出现于绝经后妇女和老龄男性，全球有逾亿万妇女患有骨质疏松，其中每年约九百万人由于骨质疏松而出现骨折，因此，该疾病已成为国际重要公共卫生问题和前沿科研难题［3］.随着对OP 研究的不断深入，黄芪在临床组方使用频率位于前列，已然成为中药研究干预骨质疏松的热点［4］.黄芪（Astragali Radix）为我国常用补益中药，以补气为长，黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是黄芪的重要活性成分之一，现代药理研究发现其可显著改善骨质疏松大鼠骨密度，缓解骨微结构破坏，且促进成骨细胞活性，维持骨环境稳态［5-6］，但相关机制研究还不够全面.因此，本文借助网络药理学的研究方法结合分子对接结果，初步阐明黄芪多糖治疗骨质疏松的化学活性物质及作用靶点通路，为扩大该药物临床实用提供宝贵理论依据.

1 材料与方法

1.1 黄芪多糖化学成分及靶点筛选

本文通过对黄芪多糖相关化学成分实验归纳总结，并将所得化合物逐一导入Swiss Target Prediction 数据库，得到各化合物核心作用靶点，即为黄芪多糖核心基因靶点.

1.2 骨质疏松相关靶点筛选

以“Osteoporosis”“OP”等为检索关键词，检索Gene Cards 数据库、DRUG BANK 数据库、OMIM 数据库、TTD 数据库获取骨质疏松核心基因靶点信息.在这些数据库中，DRUG BANK数据库以临床实验结果构建，Gene Cards、OMIM、Therapeutic Target Database 数据库基于文献研究构建，因此，选用多个数据库进行骨质疏松基因靶点获取有益于得到更加系统的靶点数据.

1.3 黄芪多糖成分-骨质疏松靶点

将“1.2”项所得靶点信息导入STRING 分析平台，以物种为“智人”，置信度0.4 为标准，分析建立PPI 网络拓扑关系，借助Cyto Scape 3.7.2软件进一步优化结果，获得黄芪多糖干预骨质疏松关键基因靶点信息.

1.4 GO 功能富集及KEGG 通路富集

将“1.3”项结果导入Metascape 平台进行核心基因靶点的生物信息数据富集分析，其中包括GO BP（生物过程）、GO MF（分子功能）、GO CC（细胞成分）及KEGG 通路.将筛选结果构建富集条形分析图及通路气泡图.

1.5 成分-靶点-通路网络图的构建

整理“1.4”项分析结果及黄芪多糖-骨质疏松交集基因数据并导入Cyto Scape3.7.2 软件建立黄芪多糖成分-靶点-通路网络拓扑图.根据介度、连接度等分析得到该网络中的核心靶点及药物干预疾病的核心成分.

1.6 分子对接计算验证

通过对1.3 项结果分析得到该网络中度值排名最高的5 个靶点蛋白，并结合RCSB 平台下载该蛋白pdb 格式，借助Openbabel 软件将黄芪多糖活性前5 化合物转化为pdb 格式.借助PyMol 及AutoDock 软件对蛋白及化合物进行预处理并进行分子对接，以结合能（Affinity）作为判断二者结合活性的参考.

2 结果

2.1 黄芪多糖主要化学成分基因靶点预测

通过文献研究共收集到11 个黄芪多糖所含化合物.利用Swiss Target Prediction 平台进行预测并去除所有重复基因后，共计得到241 个预测靶点.

2.2 黄芪多糖与骨质疏松相关基因靶点获取

利用GeneCards 平台共收集到骨质疏松相关靶点5 260 个，选取Score≥0.98 的结果结合TTD、DRUG BANK、OMIM 数据库进行补充，共获得1 449 个核心疾病靶点.将黄芪多糖核心靶点与骨质疏松核心靶点取交集，VENN 分析得到48 个核心作用靶点，见图1.

图1 黄芪多糖-骨质疏松靶点VENN 图

2.3 PPI 网络构建

将“2.2”项所得48 个交集靶点导入STRING 11.5 平台做PPI 网络分析，见图2.该网络共44个节点数，213 条边，根据度值推测CASP3、VEGFA、PTGS2、IL1β 等为核心靶点.

图2 黄芪多糖-骨质疏松靶点PPI 网络

2.4 GO 功能富集和KEGG 通路富集

利用Metascape 平台对交集基因进行生物信息富集分析，GO 分析结果包括GO BP 584条，GO CC 17 条，GO MF 50 条；KEGG 富集分析得到93 条信号通路；将GO 及KEGG 度值排名前20 条的分析结果建立生物信息富集分析图（GO CC 取17 条），见图3.

图3 黄芪多糖主要成分潜在靶点的富集分析

2.5 黄芪多糖成分-靶点-通路网络的构建

使用CytoScape3.7.2 软件建立“黄芪多糖成分-靶点-通路”网络拓扑关系图，并分析得到黄芪多糖干预骨质疏松靶点网络信息数据、核心化学成分及作用靶点，见图4.此网络包含272 个节点1 063 条边，其中橙色节点表示黄芪多糖潜在作用靶点，黄色节点表示活性化学成分，绿色节点表示潜在信号通路，连线代表不同节点间的作用关系.

图4 黄芪多糖干预骨质疏松化学成分-靶点-通路图

通过对网络分析发现，该网络平均度值为5.078，平均介度为0.007，平均紧密为0.348，且黄芪多糖每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，说明黄芪多糖内的多种成分可能通过多靶点干预骨质疏松.其中ASP10（葡聚糖）度值为100，介度为0.315，紧密度为0.465，推测ASP10 可能是黄芪多糖治疗骨质疏松的核心化学成分（表1）.CASP3、STAT3、JUN、VEGFA 靶点基因度值排名靠前（表2）.

表1 黄芪多糖主要活性成分网络节点特征参数

表2 黄芪多糖主要活性成分靶点网络节点特征参数

2.6 黄芪多糖分子对接筛选

将黄芪多糖中排名前5 的化合物与CASP3、VEGFA、JUN、LI-1β、TLR4 5 个核心蛋白进行分子对接，得到25 组化合物-蛋白对接结果.其中Affinity ＜-2 kcal·mol-1的对接结果有13个，其中对接得分最高的为ASP9-IL-1β，分值为-3.76 kcal·mol-1.本文对接结果为进一步进行黄芪多糖相关实验提供理论支撑，对接结果见图5，核心对接模式见图6.

图5 分子对接结果

图6 黄芪多糖部分核心化合物分子对接模式

3 讨论

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少、骨组织中微细结构被破坏为特点的全身代谢性骨病［7］.我国50 岁以上人群骨质疏松患病率高达19.2%，是骨质疏松高发区［8］，因此，寻找治疗骨质疏松的药物成为亟待解决的关键问题.近年来随着研究的不断深入，黄芪已然成为治疗骨质疏松的关键药物，在治疗OP 用药频次位列前五，是治疗骨质疏松中药的研究热点［9］.

中医并无骨质疏松相关叙述，但根据病症、病因将其归属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴［10］.《黄帝内经》记载“肾藏精，主骨”.指出肾脏乃先天之本，肾精充实则主骨和生髓有力，肾精亏虚则骨髓生化无源［11］.“髓减骨枯，骨质脆弱，易致骨折”，由此可知，维持肾精充养是治疗骨质疏松的重要手段.故中药治疗骨骼松动时，以补肾填精为先，以健脾养血、通络活血、强筋壮骨为辅［12］.研究表明，黄芪具有能改善骨形成的功效，进而治疗骨质疏松症［13］.

黄芪始载于《神农本草经》，位列上品，有补气升阳，生津养血，补益肾气的作用.黄芪多糖是黄芪的重要活性成分，主要由酸性杂多糖组成，有调控免疫、抗氧化及治疗骨质疏松等功效［14-15］.本文借助网络药理学和分子对接的方法，通过对关键交互网络的分析结合分子对接结果初步探讨了黄芪多糖治疗骨质疏松的潜在成分和作用机制.

3.1 潜在成分及靶点分析

通过文献调研结合网络药理学分析发现，黄芪多糖作用于骨质疏松的主要成分为葡聚糖、鼠李糖及半乳糖等.研究表明，黄芪多糖可促进成骨细胞增殖分化，维持骨形态稳定，达到治疗骨质疏松的作用［16］.

通过对PPI 网络拓扑关系分析发现，黄芪多糖11 个活性成分对应241 个基因靶点，其中与骨质疏松疾病交集靶点有80 个.参考Degree 值分析后发现，该网络中CASP3、STAT3、JUN 等靶点排名靠前，因此，推测上述靶点可能在黄芪多糖干预骨质疏松中发挥关键作用.Caspase 家族在细胞凋亡中发挥重要调控作用，其中Caspase-3 可被多种趋化因子激发酶连反应，是促进细胞凋亡的下游关键调节效应子［17］.在成骨细胞参与骨形成过程中，Caspase-3 基因大量表达将引起成骨细胞凋亡，进而引起骨形成，抑制骨质疏松的发生［18］.STAT3 位于细胞质内，可被多种细胞因子瞬时激活并介导细胞增殖分化过程，是该过程的重要核转录子，在成骨细胞分化过程中有负反馈作用［19］.研究表明，黄芪多糖可促进小鼠成骨细胞增殖分化，推测该过程与抑制Caspase-3、STAT3 活性、拮抗细胞凋亡有关［20］.JUN 是MAPK 通路的下游蛋白，调节JUN 活性与成骨细胞中胶原蛋白合成有较强的相关性，因此，抑制JUN 激活有利于干预成骨细胞功能不全导致的骨质疏松［21］.

3.2 生物富集分析

KEGG 分析发现黄芪多糖主要通过AGERAGE、EGFR、IL-17、Inflammatory Mediator 等通路干预骨质疏松.AGE-RAGE 信号通路由RAGE作为多配体的跨膜受体识别体内AGEs 产物水平介导胶原交联的作用，其可影响还原糖和游离氨基反应，减弱骨骼硬度，此外，AGEs还可拮抗骨髓间充质干细胞增殖分化作用并加速细胞凋亡，表明该通路与骨生成关系密切，在骨质疏松的防治中有重要作用［22-23］.EGFR 是表皮生长因子家族的重要受体，可促进骨细胞增殖分化，维持骨环境稳态促进骨形成，有研究表明敲除siRNA 抑制EGFR 可显著改善成骨细胞的炎症反应［24-25］.本研究结果也显示，黄芪多糖干预骨质疏松与IL-17 和Inflammatory Mediator 通路有关，且有实验表明黄芪可作用于EGFR 通路，因此，推测黄芪多糖治疗骨质疏松可能与通过抑制EGFR 通路活性，进而减少骨细胞炎症反应有关［26］.

4 结语

本研究借助网络药理学及分子对接的研究方法，初步阐明黄芪多糖防治骨质疏松的作用机制.结果提示黄芪多糖可通过葡聚糖、鼠李糖、半乳糖等成分作用于CASP3、STAT3、JUN 等靶点参与AGE-RAGE、EGFR、Inflammatory Mediator 等通路治疗骨质疏松，为进一步探索黄芪治疗骨质疏松的物质基础和作用机制提供宝贵的理论依据，但由于网络药理学研究存在一定的局限性，后续研究团队将围绕本研究结果进一步开展实验，以期验证黄芪多糖治疗骨质疏松的作用机制，为中药治疗骨质疏松提供新思路.