纳木措沿岸区可培养细菌多样性季节差异及其理化影响因素

郑艳艳,贺 凯,孟华旦尚,德 吉,郭小芳① (.西藏大学理学院,西藏 拉萨 850000;2.西藏自治区高原生物研究所,西藏 拉萨 850000)

湖泊是研究生态系统响应外界环境变化的重要场所,其中蕴含着大量的微生物资源,这些微生物推动着湖泊生态系统的物质能量与元素循环,维持着湖泊生态系统的平衡[1]。湖泊细菌作为湖泊生态系统中食物网的重要组成部分及有机物的主要分解者,探究其物种多样性、群落分布及其对环境因素的响应,对于湖泊生态系统的保护有着深远意义。

青藏高原位于亚欧大陆中南部,是我国的西南边陲[2],该地区湖泊星罗密布,湖泊总面积超过全国湖泊总面积的50%[3]。青藏高原素有“亚洲水塔”之称[4],这些湖泊受人为干扰较小,且多数位于封闭的内流区,因此能够极为迅速地响应气候与冰冻圈的变化,是气候变化的前哨[5-6],是研究圈层相互作用的重要纽带[7-8]。纳木措地处藏北高原东南部、冈底斯山脉与念青唐古拉山脉北麓之间,湖泊总面积为2 020 km2[9],是一个典型的高原封闭湖泊,关于纳木措水体细菌免培养部分的研究较多[10-13],而可培养部分的研究较少[14]。目前系统针对纳木措可培养细菌物种多样性、群落结构及其对水质理化参数的响应规律的研究鲜有报道。该研究拟在了解纳木措不同季节细菌物种多样性、群落结构差异的基础上,探究影响其多样性与群落分布的主要水质理化参数,以期为其中特殊细菌资源的开发和利用提供资源和参考,同时也可为青藏高原湖泊生态系统的保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与水样采集

纳木措流域(30°00′～31°10′ N,89°30′～91°25′ E)地处藏北高原东南部,流域面积约10 600 km2,湖面平均海拔约为4 718 m,湖泊北部是起伏较小的丘陵,东南部是念青唐古拉山脉,整个区域形成了一个相对封闭的盆地,具有典型的高原草地湖泊生态系统特征,生物多样性丰富[15]。

分别于2020年8月(夏季)、2021年5月(春季)以及2021年10月(秋季)对纳木措进行水样采集。根据纳木措水体分布情况结合地理位置差异,共选择20个样点采集水体(图1),由于条件限制无法租用船只进入湖面及湖中央,因此仅在纳木措沿岸区选取采样点[16]。用无菌采样器在距岸边约15 m、距水表约50 cm处采集水样,每个样点约采集7.5 L水样,将其平均装入3个无菌塑料桶中,1份水样立即送至西藏博源环境检测有限公司测定水质理化参数,1份水样带回实验室立即分离其中的可培养细菌[16]。

1.2 水体可培养细菌的分离、纯化及保藏

采用直接涂布平板法与稀释涂布平板法相结合进行细菌的分离培养。将各个样点的水样分别用移液枪取100 μL接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上,使用无菌涂布器将其涂匀后,于恒温箱中28 ℃条件下倒置培养,每个样点设3个重复。待平板上菌落清晰可见时取出现30～300个菌落数的平板进行计数,其中菌落数过多的样点则采用稀释涂布平板法重新进行分离培养。根据菌落形态、颜色、大小等不同表型特征进行初步筛选,选取不同的单菌落进一步分离纯化。通过平板四区划线法获得单菌落,将其接种于斜面培养基上生长2～3 d后进行菌株的分子鉴定及菌种的保藏,保藏液使用φ=20%的甘油,于-20 ℃条件下冷冻保藏[16]。

1.3 代表菌株的分子鉴定

采用16S rDNA基因测序技术进行菌株的分子鉴定。使用的上、下游引物为细菌通用引物[17],由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR结束将扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测后送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序,所有序列均已测通[16]。

将供试菌株的测序结果进行人工处理后,在NCBI数据库中进行同源序列搜索,从而确定细菌的分类地位。将供试菌株的序列上传至NCBI核酸数据库并获取登录号,春季供试菌株登录号为OK036813-OK036870,夏季供试菌株登录号为MW799879-MW799953,秋季供试菌株登录号为OM010252-OM010326。

1.4 水质理化参数的测定

用多参数测试笔原位测定水样pH值、温度、电导率、盐度和总溶解固体量,每个参数重复测定3次。总氮、总磷、化学需氧量、氨氮和浊度5项理化因子送至西藏博源环境检测有限公司进行测定[16]。

1.5 数据处理及分析

数据的处理与分析使用Excel 2010、R 4.1.1、SPSS 22.0与Canoco 4.5等软件进行,绘图使用ArcGIS 10.5、R 4.1.1和Origin 2019b等软件进行。样点分布图使用ArcGIS 10.5绘制;采用SPSS 20.0软件,运用Duncan检验法对细菌总丰度进行差异性分析;采用R 4.1.1中的vegan包进行多样性指数计算;采用Excel 2010软件计算细菌的相对丰度、出现频率及总丰度。

使用R 4.1.1软件进行正态性检验与方差齐性检验,根据检验结果进行方差分析,再根据方差分析结果选择是否进一步进行Tukey差异显著性检验;使用R 4.1.1中的vegan包和ape包,对不同季节细菌群落结构进行基于Bray-curtis距离算法的主坐标分析(PCoA),并用相似性分析检验组间差异是否大于组内差异;使用R 4.1.1中的vegan包和phangorn包,运用非加权组平均法(UPGMA)计算得到β多样性距离矩阵,再进行层级聚类分析;采用R 4.1.1进行最小显著性差异(LSD)检验;使用CANOCO 4.5进行细菌群落分布与理化参数之间的排序分析;使用R 4.1.1中的vegan包对环境因子差异与群落结构差异的相关性进行Mantel检验;依据赤池信息量(AIC)准则,使用R 4.1.1软件中的多元逐步回归分析建立各群落多样性指数与环境因子之间的最优模型,得出多元回归方程。

2 结果与分析

2.1 纳木措水体可培养细菌物种多样性的季节差异

2.1.1水体可培养细菌总丰度的季节差异

对不同季节细菌总丰度进行统计可知,春夏秋3个季节总丰度分别为1.67×106、8.19×106、8.38×105L-1,即总丰度在夏季最高、秋季最低。Duncan差异性分析结果显示,3个季节间细菌总丰度虽存在差异,但未达显著水平(P>0.05)。

2.1.2水体可培养细菌物种多样性的季节差异

采用细菌物种数、属数、Shannon-Wiener 多样性指数、Simpson优势度指数及Pielou均匀度指数对细菌多样性进行评估(图2)。

*表示P<0.05。

结果显示,细菌物种数在春季最多、夏季最少,另外4项指数均在秋季最高、夏季最低。分别对各项物种多样性指数进行方差分析,结果表明,物种数(P=0.018)、属数(P=0.019)、Shannon-Wiener多样性指数(P=0.025)及Simpson优势度指数(P=0.029)在不同季节间均存在显著差异(图2),而Pielou均匀度指数在3个季节间差异未达显著水平(P=0.791)。使用Tukey检验分别对上述各季节间存在显著差异的4项指数进行两两比较,这4项指数均仅在夏秋间存在显著差异(P<0.05),而春夏间、春秋间差异均未达显著水平(P>0.05)。

2.2 纳木措水体可培养细菌群落结构季节差异

为探究细菌群落结构差异的季节性变化,计算了不同季节水样间的Bray-curtis距离,使用PCoA来绘制不同季节水样的二维分布图。由图3可见,不同季节细菌群落结构存在一定差异,其中春季和夏季的样品点在坐标轴上距离相对较近,且有少量重叠部分,这表明春季和夏季水样中细菌群落结构比较相似;而秋季样品点与春季、夏季样品点在坐标轴上距离均较远,说明秋季水样中的细菌群落结构与春季、夏季差异较大。此外,与秋季样品点相比,春季、夏季样品点在排序图上的分布格局较疏散,而秋季样品点分布格局较为集中,说明秋季细菌群落空间分化程度较春季和夏季低。春季和夏季受雨季降雨量大和冰川、积雪融水的影响,纳木措湖泊水体扩散能力增强,从而导致细菌群落结构在空间上具有较高的相似度。使用UPGMA计算β多样性距离矩阵并进行层级聚类分析,可视化呈现不同季节样本中群落结构的相似或差异程度,其结果验证了PCoA分析结果。

图3 不同季节间细菌群落组成的主坐标(PCoA)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacterial community composition in different seasons

通过ANOSIM检验组间差异显著性来判断分组是否有意义。从图4可见,组间差异显著大于组内差异(r=0.87,P=0.001),说明分组有意义,表明随着采样季节的改变,水体细菌群落结构也会发生显著变化。

图4 不同季节间细菌群落组成的相似性分析Fig.4 ANOSIM of bacterial communities in different seasons

2.3 纳木措水体可培养细菌物种组成季节性比较

通过传统纯培养方法从3个季节水样中分别获得可培养细菌559、681、637株,共计1 877株。分子鉴定结果显示,春季559株细菌隶属于4门7纲12目16科22属48种,夏季681株细菌隶属于4门6纲11目15科16属43种,秋季637株细菌隶属于4门7纲14目20科25属46种,所有菌株隶属于4门7纲15目26科34属87种。在3个季节中,春季物种数最多。

根据分类学分析结果可知不同季节各个分类单元水平上的物种组成情况。就门分类水平而言,3个季节水样中的物种均分布于4个细菌门,分别为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)以及变形菌门(Proteobacteria)。在春季水样中,厚壁菌门(Firmicutes)为优势门,占比为51.04%;而在夏季和秋季水样中,变形菌门为优势门,占比分别为72.00%和62.67%。在属分类水平上,3个季节间共有属包括气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等12属,占比为35.29%;春夏共有属较多,包括不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属等15属,占比为65.22%;春秋共有属包括气单胞菌属、芽孢杆菌属等14属,占比为42.42%;夏秋共有属包括气单胞菌属、芽孢杆菌属等12属,占夏秋所有属的41.38%。此外,3个季节的特有属分别为5、1、11个。就种分类水平而言,根据不同季节细菌物种数的韦恩图(图5)可知,3个季节共有物种包括温和气单胞菌(Aeromonassobria)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等13种,占比为14.94%;春夏共有物种包括约氏不动杆菌(Acinetobacterjohnsonii)、米不动杆菌(Acinetobacteroryzae)等30种,占比为49.18%;春秋间共有物种包括温和气单胞菌、短小芽孢杆菌等16种,占比为20.51%;夏秋间共有物种包括温和气单胞菌、短小芽孢杆菌等17种,占比为23.61%。此外,春夏秋3个季节的特有种分别为15、9、26个,秋季细菌特有属最多,推测秋季细菌特异性显著高于其余2个季节是导致秋季细菌群落多样性较高的原因之一。

图5 不同季节间细菌物种数与属数的韦恩图Fig.5 Venn diagrams of the number of bacterial species and genera in different seasons

春季水样中,约氏不动杆菌与波波夫气单胞菌(Aeromonaspopoffii)为优势种,相对丰度分别为15.21%、14.31%,出现频率分别为100.00%、95.00%;夏季水样中,优势种为约氏不动杆菌和腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens),相对丰度分别为27.17%、18.36%,出现频率分别为100.00%、95.00%;秋季水样中,脓毒假单胞菌(Pseudomonasanguilliseptica)的相对丰度最高,为9.58%。

根据方差分析结果,选择LSD检验法来筛选在各季节间差异均达显著水平的属和种。检验结果表明,就属而言,不动杆菌属在3个季节间均存在极显著差异(P<0.01),其余33个属在3个季节间差异不显著(P>0.05);就种水平而言,约氏不动杆菌在3个季节间均存在极显著差异(P<0.01),中间气单胞菌(Aeromonasmedia)在3个季节间均存在显著差异(P<0.05)(图6),其余85个种在3个季节间差异未达显著水平(P>0.05)。

图6 不同季节间存在显著差异的物种的丰度热图Fig.6 Heatmap of species abundance that differ significantly in different seasons

2.4 纳木措各季节可培养细菌群落分布及多样性对理化参数的响应

2.4.1水质理化参数的季节性变化

细菌作为水体中重要的微生物类别,其多样性及群落结构会对水体理化参数的变化作出一定响应。对各季节水体理化参数进行方差分析,根据方差分析结果选择是否进一步对其进行两两比较。方差分析结果(图7)显示,电导率、盐度、总溶解固体量、化学需氧量及总氮浓度在各季节间差异未达显著水平。

图7 不同季节间电导率、盐度、总溶解固体量、化学需氧量与总氮浓度的差异比较Fig.7 Comparison of EC, Salinity, TDS, COD and TN in different seasons

其余5项理化参数在不同季节间存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。就pH值而言,春季最高,夏季与秋季较低,且在春夏间(P=0.017)、春秋间(P=0.019)均存在显著差异;就温度而言,夏季最高,春季最低,在春夏间(P=0.000)、春秋间(P=0.001)、夏秋间(P=0.000)均存在极显著差异;氨氮浓度在春季较高,在夏季与秋季较低,且在春秋间存在显著差异(P=0.021);总磷浓度同样在春季较高,在夏季和秋季较低,且在春秋间存在显著差异(P=0.020);就浊度而言,同样在春季最高,在夏季与秋季最低,且在春夏间(P=0.018)、春秋间(P=0.018)均存在显著差异(图8)。

*表示P<0.05,***表示P<0.001。

2.4.2各季节可培养细菌群落分布对理化参数的响应

使用物种-样本数据进行去趋势对应分析(DCA),结果显示前4轴最大值为3.9,因此单峰模型和线性模型均适用[19]。选择单峰模型典范对应分析(CCA)来探究水质理化参数对不同季节细菌群落结构的影响。

基于细菌丰度和理化参数的典范对应分析结果见图9。图9剔除了对细菌群落分布影响不显著的理化参数(电导率、盐度及总氮浓度),保留了对细菌群落分布影响显著的理化参数(总溶解固体量、总磷浓度、化学需氧量、温度、浊度、氨氮浓度与pH值,P=0.038)。

图9 不同季节细菌群落分布与环境因子的典范对应分析Fig.9 Canonical correspondence analysis of bacterial community distribution and environmental factors in different seasons

对细菌群落分布影响最大的理化因子是总溶解固体量,其中化学需氧量与总溶解固体量具有协同作用,与春季、秋季细菌群落分布呈正相关,与夏季细菌群落分布呈负相关;氨氮浓度、总磷浓度、浊度与pH值表现出较为相似的分布特征,与春季细菌群落分布呈正相关,与夏季和秋季细菌群落分布呈负相关;温度与夏季细菌群落分布呈正相关,与春季和秋季细菌群落分布呈负相关。温度与总溶解固体量、化学需氧量、浊度、总磷浓度、氨氮浓度及pH值呈负相关,即水温升高时,水体中有机质、营养物质等含量均会下降。

2.4.3Mantel检验

采用Mantel检验分析水样间细菌群落结构差异与理化参数差异的相关性。通过Bray-curtis 距离确定细菌群落结构的差异,通过欧氏距离确定理化参数的差异[18-19]。从表1可知,各季节间水温、总溶解固体量、化学需氧量和浊度的差异与细菌群落结构的差异呈极显著相关(P<0.001);各季节间氨氮和总氮浓度的差异与细菌群落结构的差异呈极显著相关(P<0.01);而不同季节间pH值、电导率、盐度及总磷浓度的差异与细菌群落结构的差异间相关性未达显著水平(P>0.05)。

表1 纳木措细菌群落组成和环境变量的Mantel检验Table 1 Mantel test for bacterial community composition and environmental variables of Namco Lake

表2 水质理化参数对细菌群落多样性指数的逐步回归分析Table 2 Stepwise regression analysis of water physicochemical parameters to bacterial community diversity index

2.4.4纳木措水体可培养细菌群落多样性指数与理化参数的多元逐步回归分析

将物种数、属数、总丰度、Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数及Pielou均匀度指数这6项群落多样性指数作为因变量,将pH值、温度、电导率、盐度、总溶解固体量、化学需氧量、氨氮浓度、总氮浓度、总磷浓度及浊度这10项理化参数作为自变量,依据赤池信息量准则,使用多元逐步回归分析建立各多样性指数与理化参数间的最优模型,得到多元回归方程。将上述10项自变量依次引入不同因变量的模型中,进行逐步筛选,在显著性水平为0.05时,有些自变量的回归系数不显著,故将其剔除后重新计算回归结果。

结果显示,就物种数(Y1)而言,引入回归方程中的理化参数为温度(X1)、化学需氧量(X2)和总磷浓度(X3),物种数与其最优理化参数间的多元一次回归方程为Y1=17.784-0.617X1+0.008X2+68.944X3;就属数(Y2)而言,引入回归方程中的理化参数有温度(X1)、总溶解固体量(X4)、盐度(X5)、化学需氧量(X2)和总磷浓度(X3),属数与其最优理化参数间的多元一次回归方程为Y2=12.341-0.437X1-0.078X4+0.112X5+0.005X2+39.04X3;对于Shannon-Wiener多样性指数(Y3),引入回归方程中的理化参数有化学需氧量(X2)及总磷浓度(X3),回归方程为Y3=2.098+0.000 4X2+3.802X3。上述3个线性回归模型的统计检验P值均小于0.05,说明这3个回归方程具有统计学意义,所得到的回归模型成立且为最优方程。

3 讨论

3.1 纳木措水体水质分析

方差分析结果显示,各项理化参数在各季节间存在不同程度差异,表明纳木措水质理化参数存在季节性变化。总体而言,总氮、总磷等营养盐浓度相对较低,氨氮质量浓度为 0.19 mg·L-1,总氮质量浓度为0.43 mg·L-1,总磷质量浓度为0.02 mg·L-1,根据GB 3838—2002《国家地表水环境质量标准》,上述3项水体理化指标均符合国家地表水Ⅱ类水质标准,说明纳木措水质营养水平较低,但化学需氧量高于限值。

究其原因,一方面可能由于采样点位于沿岸区域,水位偏低,用水样采集器取样时不可避免地将底泥混入水样中;另一方面可能是采样点周围为牧区,有牦牛、羊等家畜在此排泄粪便。水质季节变化一定程度上受到季节性径流和温度变化的影响[20],夏季为西藏地区的雨季,降雨量大且温度较高,使得积雪和冰川融化,降雨径流与冰川、积雪融水流经山前地带汇入纳木措湖泊,使得水体理化指标有所变化。温度是气候变化的主要影响因素之一,不仅会直接影响水体微生物的代谢速率,而且还会通过改变水体中溶解氧量来改变水体微生物的新陈代谢过程,从而影响水质变化[21]。该研究中,总氮、总磷与氨氮浓度均为春季高于夏季和秋季,这与王倩等[21]研究结果相似,这可能与湖泊水温有关,春季水样的采集于5月进行,采样时湖冰刚消融,水温较低,低温使得水体细菌的代谢活动减弱,细菌消耗水体中总氮、总磷等营养物质的能力较弱,因此这些营养物质在春季的浓度相较于夏季和秋季偏高。

3.2 纳木措水体可培养细菌群落组成

该研究中分离到的所有菌株均隶属于放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门及变形菌门,其中变形菌门为优势菌门,这与已有研究结果相似[22]。变形菌门是水环境中重要的原核生物,普遍存在于水环境中。有研究表明,其在湿地、养殖废水和深海沉积物等环境中同样以第一优势门存在[23-25]。放线菌门和拟杆菌门是水体重要的微生物,承担着水体基本功能。拟杆菌门是肠道中数量最多的革兰氏阴性菌,普遍存在于污水处理过程中,主要分解溶解性有机物[26],16S rRNA基因序列的差异能够指示水体受粪源污染程度[27],而其中的鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)在海洋等高盐浓度环境下的细菌物种组成中占有较大比例,可以降解纤维素[28]。该研究水样中鞘脂杆菌目在夏季的出现频率高于春季和秋季,而夏季气温、水分等条件适宜,纳木措沿岸区域植被丰茂,有较多马、牛、羊等家畜在湖岸活动及排便,因此鞘脂杆菌目在夏季出现频率高可能与水体受动物粪源污染的程度有关。

3.3 纳木措水体可培养细菌多样性分析

方差分析结果显示,各项群落多样性指数在季节间存在不同程度差异。总丰度在夏季最高,秋季最低。夏季平均水温较高,藻类、水生生物及微生物生长活跃,因此细菌总丰度达到最大值,这与王雪等[29]研究结果相似。究其原因,可能是夏季降雨量大且周围有冰川与积雪融水汇入湖泊中,将周边土壤中的营养物质带入水中,从而改变了湖泊理化性质[30],理化参数的变化使得细菌群落发生改变,从而对总丰度造成了影响[31]。秋季气温逐渐降低,水体中微生物数量也有所变化。Shannon-Wiener 多样性指数、Simpson优势度指数及Pielou均匀度指数在各季节间的变化趋势一致,均为夏季<春季<秋季。有研究认为,夏季细菌物种多样性最高[19,32],而笔者研究结果与其相反,即夏季细菌物种多样性最低,一方面可能因为夏季为研究区雨季,降水量大,且夏季温度较高会导致山上积雪融化,融水流入湖中会对湖水产生扰动,使得水体扩散能力增强,导致水体同质化,进一步促进细菌群落结构的同质化;另一方面可能因为夏季为旅游旺季,该期间人为影响较大,可能会破坏湖水中细菌的正常群落结构[33],进而影响水体细菌物种多样性。由主坐标分析等结果可知,纳木措水体春夏间细菌群落结构相似度较高,而春秋间、夏秋间相似度较低。一方面可能是由于春季气候开始转暖,夏季气温较高,山上的积雪等融水在汇入湖泊时往往会带入大量土壤、沙石等物质,使得湖水理化特征趋于同质化,进一步改变其细菌群落组成;另一方面可能是由于春夏两季湖泊沿岸区域植被茂盛,家畜放牧较多,且家畜会在岸边饮水、排便等,这些活动在一定程度上也会对水体细菌的群落组成造成干扰。

3.4 纳木措水体理化因子对细菌群落的影响

笔者研究中,温度对细菌群落分布有着一定程度的影响。随着温度的升高,细菌细胞中生化反应速率和生长速率均会加快,但温度超过一定数值也会使细胞结构和功能受到影响[34]。细菌生长同样需要一个合适的酸碱环境,不同类别的细菌有其最适宜的pH范围。LANGENHEDER等[35]研究发现,细菌在酸性湖泊中生长会受到抑制,表明不同 pH值对细菌群落结构有一定的选择性。该研究中,采样点均属于弱碱性环境,适合大部分细菌生长,同时也存在一定的梯度,会对细菌群落分布有一定的选择性。湖水营养盐浓度对细菌群落结构也有重要影响,研究表明若湖泊营养水平较低,营养盐浓度可能会影响细菌生长[36],笔者研究结论与其一致。

4 结论

通过传统纯培养技术从纳木措3个季节水样中分离到1 877株可培养细菌,隶属于4门7纲15目26科34属87种,可见纳木措水体可培养细菌资源较丰富。对细菌群落多样性季节差异及其理化影响因素的分析结果显示,细菌总丰度在夏季最高、秋季最低,Shannon-Wiener多样性指数、Simpson优势度指数及Pielou均匀度指数均在秋季最高、夏季最低,总溶解固体量是对各季节细菌群落分布影响最大的理化参数,各季节间总溶解固体量、温度、化学需氧量和浊度的差异与细菌群落结构的差异呈极显著相关。