住宅厨房给水管网末梢微生物多样性分析

高 将,张宝军,孙 悦,袁 涛

(1.江苏建筑职业技术学院建筑智能学院,江苏徐州 221116;2.中国矿业大学环境与测绘学院,江苏徐州 221116;3.徐州市水处理工程技术研究中心,江苏徐州 221116)

饮水安全是人类健康和生命安全的基本保障[1]。建筑物内部给水横支管称为给水管网末梢,它通过角阀、编织软管与用水附件直接相连。在不用水的状态下,给水管网末梢中水是不流动的,往往在管网内部及管道附件、连接管部位形成死水。研究[2]表明,有1/3的出厂水和末梢水消毒剂余量不达标,在给水管网末梢存在微生物富集的风险,也有报道[2]称部分农村地区生活饮水存在一定的健康安全隐患。

给水管网末梢水质一直是饮用水安全研究的热点,但多集中于管网内部新污染物[3-5]、生物膜[6-8]以及消毒副产物[9-11]等方面,对阀门、龙头等给水附件以及与之相连的编织软管内部微生物多样性研究较少。近年来随着分子生物学技术的发展,宏基因组学(metagenomics)基因测序技术逐渐被应用于饮用水微生态的研究[12-13],借助于该技术,国内外学者在供水系统微生物多样性测序方面进行了广泛研究[14-16]。本研究基于宏基因组学测序技术,对房龄超过10年的厨房给水管网末梢水进行采样测定,获取建筑给水管网末梢中的菌落组成、KEGG功能、抗生素抗性基因(ARGs)、毒力因子,以期为给水管网末梢水质安全及风险评估提供基础和参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

样本采集于徐州市泉山区住宅厨房给水管道末梢,选取房龄10年以上住宅小区3个,每个小区按照与加压泵站距离的不同选择2～3栋楼房,每一栋楼房再按照给水加压分区的不同选择低区和高区两户进行采样。泉山区位于徐州市西南部,分主城区和新城区两个区域,辖区内住宅类型多样,老旧小区和新建住宅均有分布,可以很好地代表整个城市住宅情况。

分别从枝状管网(H_ZW)、厨房龙头(H_LT)以及净水器(H_PP)提取水样各10 L,置于无菌聚乙烯塑料桶中。在龙头和净水器水样提取过程中,同时将龙头、编织软管、角阀、净水器专用连接管以及净水器进行拆解,以无菌方式进行表面清理,收集混合清洗后的废液和原水样。选取孔径0.2 μm已灭菌的滤膜,将滤膜折叠放于抽滤瓶中,采用循环水真空泵进行抽滤,直至滤膜上可见明显覆盖物,滤膜样品置于-80 ℃冰箱保存。本次采集泉山区3个小区16户,共48个样本。

图1 采样点Fig.1 Sampling Points

1.2 DNA提取及建库

将滤膜置于灭过菌的管中,加入磷酸缓冲盐溶液(PBS),将膜上的富集物洗脱,离心富集至1 mL的离心管,加入蛋白酶K(10 mg/mL),50 μL的十二烷基磺酸钠(SDS,20%),颠倒混匀,55 ℃水浴2 h。加入1 mL的混合溶液酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)至2 mL,充分混匀至悬浊液状(整管呈乳白色),12 000 r/min转速下离心10 min,去除蛋白。上清液转移至新的离心管,采用异丙醇沉淀的方法收集DNA,70%乙醇漂洗两次去除杂质,最终DNA溶解在50 μL 的TE缓冲液中。采用Qubit®3.0荧光光谱仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)检测DNA的浓度,1.2%琼脂凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性,电压为5 V,时间为30 min。

利用超声波仪Covaris M220 (Covaris, Woburn, MA, USA)将各基因组 DNA 样本随机打断成300 bp左右的片段,随后按照操作说明书,利用NEBNext®UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB,USA)进行文库构建,采用Agencourt AMPure XP(Beckman,USA)进行磁珠纯化,并用GenNextTMNGS Library Quantification Kit(Toyobo,Japan)进行定量,之后采用Illumina Novaseq 6000 PE150,于微基生物科技(上海)有限公司完成宏基因组测序。

1.3 序列质控与组装

使用FASTP软件(版本0.22.0)进行质控过滤,去除质量较低长度较小的reads,同时去掉接头序列,对原始序列进行优化统计,采用MEGAHIT软件对序列进行组装。

1.4 基因预测及非冗余基因集构建

采用METAProdigal进行基因预测,预测所得基因序列,用CD-HIT软件进行聚类[参数为95%一致度(identity)、90%覆盖度(coverage)],每个类取最长的基因作为代表序列,构建非冗余基因集。采用BWA软件将质控后的reads比对到非冗余基因集,计算基因的丰度RPKM(每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)。

1.5 基因注释

在上述分析的基础上,进行一系列群落结构和功能注释等的可视化。利用R语言(版本3.6.1)进行柱状图、Heatmap展示。对厨房给水管网末梢微生物的物种组成、KEGG功能、ARGs、细菌毒力因子进行注释。

使用DIAMOND软件[17]将基因集与NCBI的NR数据库进行比对[18](BLASTP比对参数设置期望值e-value为1×10-5),选取相似性最高的序列信息作为该序列的物种信息,在界、门、纲、目、科、属、种分类学水平上进行物种注释和相对丰度统计(将每个样本注释到的开放阅读框架(ORF)进行汇总,并均一化到100%)。根据住宅厨房给水管网末梢微生物可能富集的位置不同,对H_ZW、H_LT以及H_PP 3个部位的测序结果进行汇总统计。列出不同分类层级(门、纲、目、科、属、种)相对丰度前25的物种(其余的合并为others),绘制出各对应的相对丰度柱形图。

使用DIAMOND软件BLASTP命令,将基因集与KEGG数据库、VFDB数据库进行比对[19](BLAST比对参数设置期望值e-value为1×10-5),采用RGI(resistance gene identifier)软件来对未知序列进行抗性基因分析(使用perfect+strict参数),获得基因对应的抗生素抗性功能注释信息,将比对上的ORF进行功能信息注释和相对基因丰度统计(将每个样本注释到的ORF进行汇总,并均一化到100%)。

2 结果与分析

2.1 物种组成

基于48份标本,宏基因组测序数据结果,共注释4个界、143个门、192个纲、510个目、1 092个科、3 551个属、15 909个种。以门(phylum)和属(genus)两个分类学水平上统计物种进行展示,如图2～图3所示。

图2 门水平相对丰度Fig.2 Horizontal Relative Abundance at Phylum Level

图3 属水平相对丰度Fig.3 Horizontal Relative Abundance at Genus Level

如图2所示,在门分类学水平上,H_ZW、H_PP、H_LT样品分别检测出142、120、111个门。优势菌门为:变形菌门(Proteobacteria)(71.92%,68.20%～74.01%)、放线菌门(Actinobacteria)(8.94%,5.32%～11.36%)、奇古菌门(Thaumar-chaeota)(3.30%,0.03%～8.51%),浮霉菌门(Planctomycetes)(2.90%,1.82%～4.87%),其相对丰度均大于2.50%,平均相对丰度占总序列的87.07%(83.85%～89.94%)。子囊菌门(Ascomy-cota)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、脊索动物门(Chordata)平均相对丰度均大于1.00%。

变形菌门在H_ZW、H_PP、H_LT样品中均有较大占比,该结果与Zhou等[20]的研究结果相符,分别为68.20%、73.55%和74.01%,奇古菌门在枝状管网中的含量要明显高于其他两个样品,广古菌门(Euryarchaeota)及硅藻门(Bacillariophyta)在枝状管网样本中含量较高,在龙头及人造化学纤维(PP棉)样本中含量较低。奇古菌门及节肢动物门(Arthropoda)在枝状管网和PP棉样本中含量较高,在龙头样本中含量较低甚至接近0;装甲菌门(Armatimonadetes)、担子菌门(Basidiomycota)在龙头样本中含量较高,在枝状管网及PP棉样本中含量较低。

如图3所示,在属分类学水平上,H_ZW、H_PP、H_LT样品分别检测出3 381、3 061、2 972个属。优势菌属为:鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(7.70%,0.85%～18.77%)、铁元素菌属(Ferrigenium)(4.26%,0.01%～12.74%)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)(4.19%,0.21%～6.48%)、不溶杆菌属(Immundisolibacter)(3.61%,0.07%～10.70%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)(3.22%,3.18%～3.27%),其相对丰度均大于3.00%,平均相对丰度占总序列的(22.97%,13.31%～32.90%)。其次为暂定分类亚硝化菌属(Candidatusnitrosotenuis)、博斯氏菌属(Bosea)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、单胞菌属(Brevundimonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbac-terium)、衣原体属(Chlamydia)平均相对丰度均大于1.50%,其他菌属的相对丰度合计为58.13%(47.62%～68.72%)。

铁元素菌属在H_ZW样品中占比最高(12.74%),其含量也明显高于其他两个样品,这与市政或小区管网采用金属管材有一定关系,生丝微菌属在H_PP样品中占比最高(6.48%),铁元素菌属在H_PP样品中几乎没有,鞘氨醇单胞菌在H_LT样品中占比最高(18.77%),不溶杆菌属在H_LT样品中含量明显高于其他两个样品。在H_PP样品中检测到生丝微菌属具有最高占比,这说明净水器作为直饮水的最后屏障,在过滤颗粒物、胶体甚至离子方面具有一定的优势,但仍有聚集微生物的风险。

2.2 KEGG功能注释

KEGG功能基因注释信息结果如图4所示,所有样品中微生物在数据库中注释到的基因序列表现出了丰度上的差异性和功能上的多样性,但总体差异性不明显,3组样品中注释到数量最多的通路是碳水化合物代谢(12.47%,12.30%～12.80%),这和文献[21]报道一致,其次是氨基酸代谢(10.58%,9.44%～11.55%)、能量代谢(6.80%,6.47%～7.35%)以及辅助因子和维生素的代谢(5.43%,5.10%～6.03%),4种注释基因占总质量的35.28%(34.24%～36.47%)。磷酸转移酶(phosphotrans-ferase,MPH)在微生物介导碳水化合物的摄取、磷酸化以及调节细菌毒力与应激反应方面具有重要作用[22],其在H_ZW中较其他两个样本有较高含量(13.19%),这和枝状管网余氯存有量较龙头和净化器高有很大关系。

2.3 ARGs注释

与CARD(the comprehensive antibiotic resistance database)数据库比对,注释结果如图5所示。根据最佳ARO抗性基因统计[图5(a)],adeF平均相对丰度最高(15.71%,3.66%～28.48%),其次为mphO(4.42%,0.03%～13.06%)、IMI-8(3.48%,0.02%～9.62%)、Sed-1(3.24%,0.05%～8.65%)、Bsub_mprF(3.14%,0.86%～7.32%),平均相对丰度均超过3%,5种抗性基因平均相对丰度总和占总样本的超30%。H_ZW样品中平均相对丰度较高的基因是mphO(13.06%)、adeF(3.67%);H_PP样品中平均相对丰度较高的基因是adeF(14.97%)、IMI-8(9.62%);H_LT样品中adeF(28.48%)、bcrC(2.86%)两种基因平均相对丰度较高;说明3组样品中抗生素耐药类型主要为外源泵类,其次为大环内酯类。

图5 抗性基因统计Fig.5 Statistics of ARGs

由AMR基因家族抗性基因统计[图5(b)]可知,耐药结节化细胞分化家族(resistance-nodulation-cell division,RND)在所有样品中相对丰度均为最高,平均相对丰度(23.72%,13.57%～37.73%),其他含量相对较高的抗性基因还有主要易化子超家族(macrolide major facilitator superfamily,MFS)(6.30%,3.57%～8.01%)、MPH(4.78%,0.39%～13.19%)、OXA型β-内酰胺酶(OXA beta-lactamase)(4.69%,3.40%～6.23%)、防御素抗性双功能细菌抗性蛋白(defensin resistant mprF)(4.03%,1.98%～7.51%),其相对丰度均大于4.0%,平均相对丰度占总序列的43.52%(34.72%～52.87%)。RND是细菌产生耐药性的重要机制[23],其能使得细菌对药物的耐药性迅速增加,最突出的是非肠道致病菌,可以推测龙头较枝状管网和净化器有较高的ARGs污染风险。

由抗性基因统计图5(c)可知,四环素类抗生素(12.88%,7.90%～18.49%)、氟喹诺酮类抗生素(10.96%,5.6%～17.18%)、头孢菌素(10.67%,8.91%～12.21%)、青霉烷类抗生素(10.38%,8.23%～11.89%)、大环内酯类抗生素(8.61%,6.05%～13.67%)、碳青霉烯抗生素(8.04%,5.78%～10.04%)、肽类抗生素(5.08%,4.41%～6.01%)的相对丰度均大于5.0%,平均相对丰度占总序列的66.63%(62.26%～69.11%)。大环内酯类抗生素在样品在H_ZW中明显高于其他两个样品;氟喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素在样品在H_LT中有较高丰度值。3组样品中药物种类丰度最高的为四环素类和氟喹诺酮类抗生素,这与Li等[7]的研究结果一致,而耐药基因数量最多的则为外排泵类和大环内酯类,说明3组样品中大部分最佳ARO抗性基因绝对丰度并不高。

由抗性基因统计图5(d)可知,3组样品中平均丰度较高的基因有抗生素灭活(39.97%,29.48%～51.02%)、抗生素外排泵(34.01%,25.31%～49.01%)、抗生素靶点结构改变(18.12%,15.98%～22.22%)三者平均相对丰度占样品总丰度的92.10%(89.34%～94.64%);抗生素灭活在H_ZW和H_PP样品中平均相对丰度较高,分别为51.02%和39.42%,H_LT样品中,抗生素外排泵具有最高丰度值为49.01%。在ARO耐药机制类型方面,抗生素失活、抗生素外排泵及抗生素靶点结构改变是主要类型[24],抗生素灭活在H_ZW和H_PP样品中起主导,H_LT样品中抗生素外排泵更为关键。

2.4 毒力因子注释

通过与细菌毒力因子数据库(virulence factor database,VFDB)比对,预测获得的基因注释结果如图6所示。可知,Type IV pili基因在所有样品中含量最高,平均相对丰度为4.24%(3.14%～5.54%),其他平均相对丰度较高的基因主要有fbpABC(3.76%,2.65%～5.28%)、beta-hemolysin/cytolysin(3.39%,2.52%～4.33%)、LOS(2.98%,2.33%～3.89%)、Flagella(2.96%,2.28%～4.25%),其相对丰度均大于2.5%,平均相对丰度占总序列的17.33%(16.42%～18.85%)。Type IV pill、LOS在H_ZW中明显高于其他两个样品;Flagella、Enterobactin含量较少。fbpABC、Flagella在H_PP中较高,Flagella、Beta-hemolysin/cytolysin在H_LT中较高。

图6 VFDB数据库丰度前20和VFDB丰度前50热图Fig.6 VFDB Top 20 Abundance Column Chart and VFDB_Top 50 Abundance Heat Map

毒力因子主要包括防御型毒力因子、毒力相关基因的调控、非特异性毒力因子和进攻型毒力因子4种[25-26]。进攻型毒力因子主要与黏附、分泌系统、侵袭、细菌毒素等相关[27]。防御型毒力因子主要与位相变异、血清抵抗、抗吞噬作用、应激蛋白、酶等相关[28]。Type IV pili、LOS以及Flagella具有进攻和防御双重属性,作为进攻型毒力因子时主要与黏附及细菌毒素有关,而作为防御型毒力因子时,位相变异则起到主导作用。fbpABC和beta-hemolysin/cytolysin则全是进攻型毒力因子,分别与黏附和细菌毒素有关。从病原体上进一步分析,fbpABC基因的病原体多为脑膜炎双球菌(N.meningitidis),Type IV pili基因的病原体多为土拉热弗朗西斯菌(F.tularensis),LOS、Flagella以及beta-hemolysin/cytolysin则存在于多种病原菌体内。可知,这些基因的病原体多与人类的流感、鼻窦炎、中耳炎、结膜炎、脑膜炎等相关。

3 结论与展望

(1)住宅厨房给水管网末梢中细菌群落的丰度值在不同分类学水平上具有一定差异性,住宅厨房给水管网末梢不同部位可能存在多种微生物,并且具备不同的特定功能,住宅厨房给水管网末梢不同部位均有微生物富集的风险。通过调控市政给水管网加氯量和增设小区管网自加氯系统等方式可以在一定程度上降低此类风险,也建议居民将自来水烧开后再进行饮用。

(2)碳水化合物代谢(12.47%,12.30%～12.80%)是住宅厨房给水管网末梢样品中KEGG注释到数量最多的通路。研究[4]表明,微生物自身及其新陈代谢中间产物与余氯反应可能会产生新的消毒副产物,研究这些新污染物的转化机制,探讨其对住宅厨房给水管网末梢饮用水微生物学风险的影响具有重要意义。

(3)与饮用水源地、净水厂、市政给水管网、小区给水管网、二次加压水箱一样,建筑物内给水管网同样存在ARGs污染情况,且龙头较枝状管网和净化器有较高的ARGs污染风险,并可能对公众健康产生风险。目前城市生活饮用水供水系统并不能有效去除ARGs污染,加强水源地保护、对净水厂处理工艺进行升级改造是控制此类新污染物的有效手段。

(4)进攻型毒力因子是住宅厨房给水管网末梢细菌毒力的主要类型,type IV pili基因(4.24%,3.14%～5.54%)在住宅厨房给水管网末梢样品中含量最高,住宅厨房给水管网末梢有一定的安全风险。未来应重视饮水系统微生物毒力因子的测定,可进一步研究某些特定毒力因子与水源性疾病之间的相关关系,以期更好地预防饮用水污染。

(5)开展给水管网附件、管件、接头以及连接管道部位微生物学研究具有重要意义,本研究不仅揭示了住宅厨房给水管网末梢微生物物种组成、ARGs、毒力因子分布情况,而且还表明H_ZW、H_LT)以及H_PP等部位均有微生物富集风险,可能对公众健康安全产生影响。未来应加强对给水管网系统末梢微生物学风险监测的频率和范围,以防止水传染疾病的发生。