活性污泥中氧氟沙星降解菌的筛选及其去除性能研究

2024-01-03黄小宸李科林吴雨霏苏文龙

陕西科技大学学报 2024年1期

黄小宸, 李科林, 吴雨霏, 苏文龙

(中南林业科技大学环境科学与工程学院, 湖南长沙 410004)

0 引言

近年来,水环境中发现了不同程度的抗生素残留[1],其中就包含我国常用抗生素中的氧氟沙星(Ofloxacin,简称OFL)[2],OFL的自然降解能力有限,人和动物使用后大部分排出体外,在水体中不断迁移积累,不仅威胁水生生物的生存,还会损害微生物的生态平衡.市政废水[3]和医院出水中[4]OFL的检出浓度在ng/L到μg/L,制药厂出水中[5]甚至达到mg/L.

目前去除抗生素的方法有物理法、化学法和生物法.物理法通常只是抗生素的物理转移,抗生素分子结构基本没有发生变化,无法起到真正的去除作用.化学法造价高,对技术与环境要求极高,在反应过程中易产生毒性副产物.生物法中的微生物处理是去除废水中抗生素的常用工艺,主要依靠微生物新陈代谢分解抗生素,但抗生素对微生物存在一定的抑制作用,只要保证微生物不被直接杀灭,微生物处理法将是最佳选择[6],因此筛选抗生素优势降解菌株的研究被提出.

Prieto等[7]发现白腐真菌能够利用漆酶降解环丙沙星和诺氟沙星;Erickson等[8]发现牛肠分离物蜡样芽孢杆菌P41可以降解头孢噻呋;郭夏丽等[9]对黄孢原毛平革菌进行固定化培养后用来降解磺胺甲恶唑,其去除率高达100%;沈东升等[10]发现高效降解葡萄球菌能够提升猪粪中土霉素约20%的去除效率;马玉龙等[11]从长期堆放泰乐菌素药渣的土壤中筛选出的无丙二酸柠檬酸杆菌与越南伯克霍尔德菌,二者均能够对泰乐菌素进行有效去除;付泊明等[12]从医药厂废水中分离得到一株诺氟沙星降解菌NOR36,去除率最大可达92.6%.由此可见,筛选优势降解菌株以消除抗生素污染具有巨大的潜力.

本研究从污水厂剩余活性污泥中驯化筛选出了一株OFL降解菌并考察了其去除性能,对于有效治理水体中残留的OFL有着一定意义及价值,为降解菌的工程化应用提供了一定的理论基础.

1 实验部分

1.1 实验材料

活性污泥取自长沙某城市污水厂剩余污泥池.OFL标准品纯度98%,产自麦克林生化科技公司.

富集培养基:CH3COONa 1.5 g,NH4Cl 2 g,K2HPO41.5 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 1.0 g,超纯水补足1 000 mL,pH 7.0.

LB培养基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,超纯水补足1 000 mL,pH 7.2.

无机盐培养基:NH4Cl 2 g,K2HPO41.5 g,KH2PO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 1.0 g,超纯水补足1 000 mL,pH 7.0.

固体培养基:在液体培养基中加入2.0%的琼脂.

1.2 实验方法

1.2.1 降解菌的筛选

在2 000 mL烧杯中投加1 500 mL的活性污泥,污泥沉降比约10%,加入OFL使其初始浓度约为500 mg/L,曝气驯化48 h.取10 mL驯化后的污泥转接至富集培养基(含有5 mg/L OFL),30 ℃、160 rpm摇床培养10天后再取10 mL污泥转接至新的富集培养基,按浓度梯度(5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L)依次增加OFL.连续转接4次后,取1 mL富集液进行10-2～10-8梯度稀释,分别取0.1 mL涂布于LB固体培养基上30 ℃培养48 h,待平板长出菌落后,挑取单菌落划线分离,纯化得到单菌落,挑取已纯化的菌株转接至无菌的含有OFL的富集培养基中进行筛选降解实验,使用分光光度计检测细菌生物量,高效液相色谱仪(HPLC)检测OFL浓度,液质联用仪(HPLC-MS)检测分析降解产物.

1.2.2 菌株的微生物学实验方法

将降解菌涂布于LB固体培养基,30 ℃培养48 h,观察菌落形态特征.

参考《常见细菌系统鉴定手册》与《伯杰氏细菌鉴定手册》,开展生理生化鉴定实验[13].

1.2.3 菌株测序及系统发育树构建

委托专业公司对菌株进行16SrDNA测序以及系统发育树的构建.

1.2.4 菌株种子液的制备

挑取LB固体平板上的单菌落,接种至LB液体培养基扩培,30 ℃、160 rpm摇床培养至对数期(OD600 nm=0.6)时,离心弃去上清液,用生理盐水洗涤菌体2次,重悬于等体积的无菌超纯水中作为种子液.

1.2.5 菌株生物量的检测

菌株生物量的检测,可参考文献[14]进行.

1.2.6 OFL含量的测定

OFL含量的测定,可参考文献[15]进行.

1.2.7 降解菌的生长降解曲线

在OFL浓度为10 mg/L的富集培养液中以10%(v/v)的接种量接入种子液,在30 ℃,160 rpm摇床培养箱中进行降解实验,每日定时取样检测,采用分光光度法测定菌株生物量OD600 nm,高效液相色谱法测定OFL残留含量.做3组平行试验.

1.2.8 环境因子对菌株去除性能的影响

选择接种量(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%,v/v),初始OFL浓度(1 mg/L、 5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L),温度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃),溶液pH(5、6、7、8、9、10),碳源(空白对照、葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、碳酸钠,浓度均为5 g/L),盐浓度(0 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L)6个主要环境因子,考察对降解菌去除性能的影响.将种子液转入无菌的富集培养基中进行降解实验,160 rpm摇床培养,采用HPLC测定OFL残余的含量.除接种量实验外细菌接种量均为10%(v/v),除初始浓度实验外OFL浓度均为10 mg/L,除温度实验外培养温度均为30 ℃,除pH实验外培养基pH均为7,除碳源实验外碳源均为乙酸钠,除盐浓度实验外盐浓度均为5 g/L,所有实验均在无菌且避光的条件下完成,每组进行3组平行试验.

1.2.9 正交试验

依据单因素试验的结论,设置三因素三水平来探究对OF01去除性能的影响.通过对正交试验和极差的分析得到OF01菌株的最佳降解条件,三因素对OF01菌株去除性能影响的主次顺序.

2 结果与讨论

2.1 降解菌的筛选

筛选得到一株对OFL有去除效果的菌株,命名为OF01,去除效率为63.79%.

降解菌OF01在LB固体平板上呈现较小的圆形灰白色不透明菌落,质地湿润粘稠、不易被挑起,边缘不规则、有褶皱,内部扁平,如图 1所示.

生理生化鉴定结果:革兰氏染色为阴性,氧化酶阳性,接触酶阳性,淀粉水解阴性,脲酶实验阴性,吲哚实验阴性,H2S实验阴性,明胶液化阴性.具体如表 1所示.

OF01菌株形态与《常见细菌系统鉴定手册》中的产碱杆菌科形态描述较为相同,并且生理生化特征与贺海燕等[16]发现的产碱杆菌属细菌的生理生化实验结果基本吻合.

OF01菌株经测序后构建系统发育树如图 2所示.结果显示OF01与Alcaligenes(产碱杆菌属)同源性达到99%以上,鉴定OF01菌株属于Alcaligenes(产碱杆菌属).

2.2 OFL降解菌的去除性能

2.2.1 降解菌OF01的生长降解曲线

降解菌OF01去除OFL的生长降解曲线如图 3所示.由图3可知,菌株在接种2 d后开始迅速增长,进入对数生长期,此时OFL浓度也开始快速下降;7 d时菌株进入稳定期,第10 d达到生物量最大值,OFL去除率达到最大值为63.79%,此后OFL去除率基本保持不变,这和菌株的生长受到抑制相关.江紫薇等[17]从土壤中分离得到的1株二甲四氯降解菌的降解特性研究中也出现了同样趋势的生长降解曲线,细菌对有机物的利用速率一般与生长所处时期相关,说明OF01菌株对OFL有一定去除能力.

2.2.2 细菌接种量对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同接种量条件下对OFL的去除效率如图 4所示.由图4可知,无细菌作用时OFL的自分解能力非常弱,细菌接种量的增加对OFL去除效率没有十分明显的影响(P>0.05),但对去除率的影响大致呈现出先增后减的小幅变化,30%(v/v)接种量的结果增高不排除为实验误差.这与张卫[18]提取的阿维菌素降解菌的特性相似,推测可能是因为在相对的生长环境下碳源有限,降解菌生长到一定数量后所需碳源不足.在实际含OFL废水处理过程中,为了保证经济实用,细菌接种量越少,成本也就相对越低,因此最佳接种量为10%(v/v).

2.2.3 初始OFL浓度对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同初始OFL浓度下对OFL的去除效率如图 5所示.由图5可知,各处理之间差异性显著(P<0.05),在初始OFL浓度1 mg/L到25 mg/L范围内,去除效率先升高后降低,初始浓度为15 mg/L时,去除率达到最大,为65.16%;OF01菌株能够利用OFL作为碳源和能源,对于OFL浓度高的废水有一定耐受性.一定条件下,初始OFL浓度的增大可提高菌株的生长和去除效果,但是当OFL浓度超过细菌的耐受能力时,细菌生长受到抑制,去除性能随之减弱,与李丽[19]分离得到的氯嘧磺隆高效降解菌的生物学研究特性一致.因此最佳初始OFL浓度为15 mg/L.

2.2.4 温度对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同温度条件下对OFL的去除效率如图6所示.由图6可知,25 ℃与30 ℃之间、25 ℃与35 ℃之间无显著性差异(P>0.05),其余各处理之间差异性显著(P<0.05).随着温度增高,去除效率先升高后降低,温度为30 ℃时,去除效率达到最大63.92%.低温使细菌代谢能力减弱、生长速度下降.温度升高增加了OF01菌株与OFL之间的粒子碰撞,从而增大OF01菌株与OFL之间的接触面积.细菌代谢需要酶来催化完成,细菌体内的酶活性在一定范围内随温度的升高而增加,而各种酶只有在最适宜的温度范围内活性才最强,酶促反应速度才最大,温度过高或过低都会影响酶的活性.因此最佳温度为30 ℃.

2.2.5 溶液pH对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同溶液pH条件下对OFL的去除效率如图 7所示.由图7可知,pH对OF01的去除效果差异性显著(P<0.05),当pH小于6大于8时,去除性能受到明显抑制,pH范围在6～8之间可有效去除OFL,pH为7时去除效率最大为63.17%,OF01菌株可耐受弱酸性和弱碱性条件,在中性条件下的去除性能最强.OFL是两性化合物,分子结构中存在羧基与哌嗪基[20],极性极强(酸性与碱性),此表现对OFL生物降解的有效性起着决定作用,即除去两性基团的位置.pH过大过小都会影响细菌细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,干扰细菌吸收营养物质和排泄代谢产物,还会影响OFL的解离,阻碍细菌吸收利用OFL.因此最佳pH为7.

2.2.6 不同碳源对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同碳源条件下对OFL的去除效率如图 8所示.由图8可知,各处理间差异性显著(P<0.05),不投加碳源时,OFL作为唯一碳源,去除效率最低;分别投加蔗糖、葡萄糖时,去除效率比较低;分别投加碳酸钠、乙酸钠时,去除效率比较高.说明额外投加碳源,形成碳源-OFL共碳源降解机制时,能显著提高OFL的去除性能,额外的碳源还可以诱导一些非特异性酶参与共代谢[21].Reis等[22]发现添加琥珀酸盐作为共代谢碳源能够显著提高降解菌 Achromobacter denitrificans PR1对磺胺甲恶唑的去除效率,Liao等[23]发现,从自来水生物过滤器中富集的微生物菌群,能够以环丙沙星为碳源进行生物降解,并且添加碳源可以促进环丙沙星的降解.因此,最佳外加碳源应是乙酸钠.

2.2.7 盐浓度对OF01去除性能的影响

OF01菌株在不同盐浓度条件下对OFL的去除效率如图9所示.由图9可知,当盐浓度为5 g/L时菌株对OFL的去除效率最大,0 g/L次之且无显著性差异(P>0.05),其它盐浓度去除效率差异性显著(P<0.05).OF01菌株盐度耐受范围广,在0～20 g/L均能较好地生长降解,是因为OF01菌株能够在盐浓度环境中积累盐离子和相容性溶质,通过分泌相容性溶质实现菌体、EPS和环境之间的渗透压平衡,以适应相应盐度环境,但在0～20 g/L范围内,随着盐浓度升高,细菌的新陈代谢能力逐渐降低,导致去除效率在此范围内逐渐降低;盐浓度在高于20 g/L时OF01菌株的去除性能受到明显抑制,酶的活性受到影响,新陈代谢逐步变得迟缓.因此最佳盐浓度为5 g/L.

2.2.8 正交试验结果分析

根据单因素实验结果,选择影响去除效率最突出的初始OFL浓度、温度与溶液pH作为研究的三个因素.三因素三水平的正交试验设计如表 2所示,正交试验结果极差分析如表 3所示.由表 3可知,当初始氧氟沙星浓度为15 mg/L,温度为30 ℃,pH为7时,去除效率可以达到最大值,因此上述组合是去除效果最佳的组合.根据极差分析结果,可知三因素对OF01菌株去除性能影响的主次顺序为pH>温度>初始氧氟沙星浓度.

表2 正交试验设计方案

表3 正交试验极差分析结果

2.2.9 降解菌OF01的优势对比

Cvancarova M等[24]发现Panus tigrinus、Dichomitus squalens和Pleurotus ostreatus三种真菌对OFL的去除率为28%、44%和36%.Shu等[25]从制药厂活性污泥中分离出一株可降解OFL的Tepidiphilus sp.M4 降解菌,在添加电子受体的条件下达到53.1%的OFL去除率.相比于以上几种降解菌,OF01对OFL的去除效果有着显著的优势,具有更好的应用前景.