C17∶0激活GPR40受体的作用及信号转导分子机制研究

马丁凌　罗序梅　唐意涵　梁毛迪　李梦环　侯艳婷　孙超月　周耐明　张君

摘要：目的 研究长链脂肪酸C17∶0对GPR40受体的激活作用，并探讨其介导的信号转导分子机制。方法 在体外培养HEK293T细胞的基础上，免疫荧光结合共聚焦显微镜检测受体膜定位和内吞情况；通过多功能酶标仪检测Ca2+流的强弱；Western Blot检测ERK1/2的磷酸化水平。结果 免疫荧光结果显示：C17∶0可通过招募β-arrestin 2介导GPR40内吞；胞内Ca2+动员检测结果证实：长链脂肪酸C17∶0可作用于GPR40引起胞内Ca2+浓度升高；Western Blot结果显示：C17∶0可作用于GPR40诱导ERK1/2磷酸化。结论 C17∶0是GPR40的内源性配体，通过激活Gaq和Gai/o蛋白介导的信号通路，引起胞内Ca2+动员及ERK1/2的磷酸化。

关键词：C17∶0；GPR40；Gaq和Gai/o；信号转导

中图分类号：R34中图分类号文献标志码：A文献标识码

Study on the effect of C17∶0 activating GPR40 receptor and the molecular

mechanism of signal transduction

MA  Dingling1，LUO  Xumei2，TANG  Yihan1，LIANG  Maodi1，LI  Menghuan1，HOU  Yanting1，SUN  Chaoyue1，ZHOU  Naiming2，ZHANG  Jun1*

（1 School of Medicine，Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases， Shihezi，Xinjiang

832000， China; 2 School of Life Sciences， Zhejiang University， Hangzhou，Zhejiang 310000， China）

Abstract：  Objective To study the activation of long chain fatty acid C17∶0 on GPR40 receptor and explore its molecular mechanism of signal transduction. Methods On the basis of HEK293T cells cultured in vitro， the localization and endocytosis of receptor membrane were detected by immunofluorescence combined with confocal microscopy; The strength of Ca2+flow was detected by a multifunctional microplate reader; The phosphorylation level of ERK1/2 was detected by Western Blot. Results The results of immunofluorescence showed that GPR40 endocytosis could be mediated by recruitment of β-arrestin2 at C17∶0; The results of intracellular Ca2+mobilization test confirmed that long chain fatty acid C17∶0 could act on GPR40 to increase intracellular Ca2+concentration; Western Blot results showed that C17∶0 could act on GPR40 to induce ERK1/2 phosphorylation. Conclusion C17∶0 is an endogenous ligand of GPR40， which can cause intracellular Ca2+mobilization and ERK1/2 phosphorylation by activating Gaq and Gai/o protein mediated signal pathways.

Key words： C17∶0;GPR40;Gaq and Gai/o;signal transduction

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus， T2DM）是一種复杂的代谢性疾病，以胰岛素抵抗（Insulin Resistance， IR）和β细胞损伤导致的高血糖为标志［1］。肥胖是导致T2DM 发生发展的重要危险因素［2-3］。有研究表明，肥胖后血浆游离脂肪酸（Free Fatty Acids， FFAs）含量升高是导致T2DM发生的关键原因［4-5］。但也有研究发现：并不是体内所有FFAs都表现出促进T2DM发生发展的作用，部分FFAs含量的增加具有改善IR和降低血糖的作用，其中包括奇数链脂肪酸［6］。

有文献报道，肥胖个体血浆奇数链脂肪酸含量降低，并与IR水平及T2DM发病风险呈负相关［7-9］。C17∶0是一种含有17个碳原子基团的饱和脂肪酸，属于奇数链脂肪酸家族。有研究显示，与同为奇数链脂肪酸的C15∶0相比，C17∶0在机体中的含量更高，并表现出与T2DM发病风险更强的负相关性［10］。此外，C17∶0可显著改善体内葡萄糖耐受能力，并降低高糖刺激下血浆胰岛素的分泌，从而发挥改善T2DM进展过程中葡萄糖不耐受的作用［11］。然而，C17∶0通过何种机制发挥上述作用，目前尚不明确。

FFAs作为人体重要的能量物质和信号分子，主要通过G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors， GPCRs）发挥调节代谢等生理作用［12］。目前已知与FFAs有关的GPCRs有5种，包括GPR40、GPR43、GPR41、GPR120和GPR84，其中长链脂肪酸可通过GPR40发挥作用［13-14］。GPR40主要在胰岛β细胞中高表达，其激活被证明能够促进胰岛素分泌和改善葡萄糖耐量［15］。大量研究表明， GPR40可参与到多条G蛋白通路中，包括Gαs，Gαi/o和Gαq途径［16］。开发合成的GPR40激动剂已经作为T2DM的治疗靶点［17］。已知偶数长链脂肪酸是GPR40受体的配体，然而奇数长链脂肪酸C17∶0是否可通过激活细胞膜上GPR40受体，发挥调控糖代谢的重要作用尚未见文献报道。

本研究在体外培养HEK293T细胞的基础上，通过免疫荧光、细胞内钙流测定以及ERK1/2磷酸化检测等方法，对长链脂肪酸C17∶0激活GPR40受体的作用，以及可能的信号转导机制进行研究，为一步阐明C17∶0发挥调节体内糖代谢作用的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基和胎牛血清购自HyClone（Beijing， China）。Opti-MEMI还原血清培养基购自Invitrogen（Carlsbad， CA， USA）。C17∶0、GPR40特异性拮抗剂GW1100、Gαi/o抑制剂PTX、PKA抑制剂H89购自Sigma-Aldrich（St. Louis， MO， USA）。Ca2+荧光探针Fura-2/AM购自Dojindo（Kyushu， Japan）。抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）和抗ERK1/2抗体购自Cell signaling Technology（Danvers， MA， USA）。Gαq抑制剂FR900359、pEGFP-N1载体及HEK293T细胞系均由周耐明教授（浙江大学生命科学学院）提供。

1.2 分子克隆及表达载体构建

Flag-GPR40由周耐明教授实验室提供，经测序验证无误，将其作为模板PCR扩增GPR40，用于PCR克隆的引物见表1。获得的PCR产物定向插入到pEGFP-N1载体的HindIII和BamHI位点。杭州擎科生物科技有限公司对上述所有结构进行测序，以验证序列和方向。

1.3 细胞培养和转染

人胚胎肾293T（HEK293T）细胞采用含10%灭活FBS、100μg·mL-1的青霉素-链霉素和1%谷氨酰胺（Invitrogen， CA）的DMEM高糖培养基，置于37℃，含5%CO2，湿度一定的恒温培养箱中培养。GPR40质粒构建体是根据使用说明，使用YEASEN转染到HEK293T细胞中。

1.4 绿色荧光蛋白定位分析

1.4.1 受体膜定位和内吞分析

转染后24 h内分别将6孔板中瞬时表达GPR40-EGFP的HEK293T细胞接种于底部放置了圆形玻璃片的24孔细胞培养板中，培养过夜。转染后36～48 h内进行后续细胞实验。首先，弃掉旧的细胞培养基，用PBS溶液润洗一次，在37℃下指定时间内下加入C17∶0处理后，用预冷的PBS洗涤细胞两次；然后在室温下用4%多聚甲醛固定10 min，移除固定液后PBS漂洗两次，加入含有DAPI的PBS溶液染色5 min。弃去后再用PBS溶液润洗两次，然后使用细长的镊子夹出圆形玻片，将其反盖在滴有5μL 50%甘油的载玻片上。制好的片子使用Fluoview软件（Olympus， Tokyo Japan）获得图像。激发在488 nm处进行，荧光检测使用505～530 nm带通滤波器。使用ImageJ软件通过线扫描强度观察荧光分布情况。

1.4.2 β-arrestin招募研究

对于研究受体对于β-arrestin1/2的招募情况，将含有GPR40-Flag的质粒和含有β-arrestin1/2的pEGFP-N1质粒以3∶1转染进HEK293T细胞，其余步骤同上。在共聚焦显微镜下观察细胞，拍摄并储存。

1.5 细胞内Ca2+测量

使用荧光钙指示剂Fura-2/AM检测细胞内钙流量。加入含有0.02% EDTA的PBS缓冲液消化表达受体GPR40的HEK293T细胞，收集细胞悬液。用Hanks缓冲液洗涤2次并悬浮。然后加入3 μL Fura-2-AM和1 μL Pluronic F-127表面活性剂，37℃培养箱孵育30 min，用Hanks缓冲液洗涤2次。根据实验需要加入不同浓度的配体，通过340 nm和380 nm的激发波长比测量68 s内的细胞内钙通量。必要时，在实验开始之前用各种抑制剂预处理细胞。不同抑制剂作用浓度分别为：GW1100，10 μmol·L-1；AH7614，10 μmol·L-1；PTX，100 ng·mL-1；FR900359，1 μmol·L-1；H89，10μmol·L-1。

1.6 蛋白质印迹分析

将瞬时转染GPR40的HEK293T细胞接种在24孔板中，并在无血清培养基中饑饿1 h，以去除本底反应。在用C17∶0刺激相应时间后，加入含有蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science）的90μL裂解缓冲液（Beyotime，China），4℃在摇床上裂解1h，然后刮除。使用SDS-PAGE（10%）对总细胞裂解液进行大小分级，并转移到PVDF膜（Millipore SCHVU01RE）。在室温下，将膜在含有0.05%Tween 20和5%脱脂奶粉的TBST中封闭1 h，然后用兔单克隆抗pERK1/2抗体（Cell Signaling Technology， USA）和抗兔辣根过氧化物酶结合二级抗体（Beyotime，China）进行检测。使用抗总ERK1/2（1∶2 000）单克隆抗体作为蛋白质负载的对照。使用增强化学发光基质（Cell Signaling Technology）检测免疫反应带，然后使用Tanon 5200化学发光成像系统（Tanon，Shanghai， China）扫描膜。ERK1/2磷酸化水平标准化为ERK1/2总量。

1.7 统计方法

应用 SPSS 26.0软件对录入数据进行统计学分析，所有计量数据首先需进行正态性检验，符合正态分布的数据选择独立样本t检验（数据以均数±标准差呈现）、不符合正态分布的数据选择非参数秩和检验（数据以中位数呈现）、多组间数据相互比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 长链脂肪酸C17∶0可作为GPR40内源性配体

已有研究表明，内吞是GPCRs激活的重要标志［18］，本研究将C端融合EGFP的GPR40真核表达质粒转染至HEK293T细胞后，运用激光共聚焦显微镜检测GPR40的定位情况，结果显示：在无激动剂存在的情况下，GPR40能够很好地定位于细胞膜上（图1A）。转染的GPR40真核表达质粒后，用100μmol·L-1 C17∶0的处理HEK293T细胞，分别在处理后第5、20、50 min，运用激光共聚焦显微镜检测GPR40的定位情况，结果显示：GPR40受体均发生了由细胞膜至细胞质的内吞现象，内吞呈点状分布且具有时间和剂量依赖性（图1B）。β-arrestin是GPCRs转运和脱敏的细胞内调控因子，β-arrestin的招募是GPCRs内吞最为典型的机制［19］，本研究结果显示：在C17∶0刺激5min和30min后，β-arrestin2从细胞质招募至细胞膜上（图1C）。

2.2 长链脂肪酸C17∶0可通过激活GPR40，促进细胞的Ca2+动员

Ca2+作为细胞内信号转导的第二信使，参与包括激素分泌，肌肉功能，神经传递，细胞分裂和分化，以及代谢调节等生理过程［20-21］。

细胞内Ca2+的瞬态变化在GPCRs介导的信号转导中发挥关键作用。为了明确C17∶0激活GPR40后是否影响细胞的Ca2+流，本研究进行了Ca2+动员检测实验，如图2A所示，过表达GPR40的HEK293T细胞在C17∶0的作用下，可诱导胞内Ca2+浓度的快速增加，并呈现一定的剂量依赖性。并且，在给予HEK293T细胞GPR40特异性拮抗剂GW1100预处理后，再进行C17∶0刺激，对细胞内Ca2+的活化情况进行检测后发现：GW1100可显著抑制C17∶0对细胞Ca2+活化的影响（图2B）。

2.3 长链脂肪酸C17∶0可通过激活GPR40，促进ERK1/2信号通路活化

细胞外信号调节激酶ERK1/2的激活，被认为是GPCRs是否激活的标志性事件［22-23］。

本研究在过表达GPR40的HEK293T细胞中发现，C17∶0刺激可诱导ERK1/2的磷酸化，且呈浓度依赖性（图3A）。时间梯度实验结果显示：C17∶0刺激30min时，GPR40介导的ERK1/2磷酸化反应最强，随着时间的延长，反应降低（图3C）。给予GPR40特异性拮抗剂GW1100处理后，C17∶0对ERK1/2磷酸化的促进作用被显著抑制（图3E）。

2.4 长链脂肪酸C17∶0可通过激活GPR40介导Gαq和Gαi/o蛋白偶联的信号通路

最初的研究发现，GPR40受体可与Gaq/11蛋白偶联激活PI-PLC，引起Ca2+活化，以及通过DAG/PKC途径激活ERK1/2磷酸化。也有研究证实Gai/o蛋白也参与GPR40介导的ERK1/2激活［24-25］。此外，有研究表明，GPR40可以与Gas蛋白有效地偶联以增加cAMP浓度［26］。

本研究通过检测细胞内Ca2+的活化情况，发现C17∶0通过GPR40介导的Ca2+的活化可以被Gαi/o抑制剂PTX部分抑制，被Gαq抑制剂FR900359几乎完全抑制。进一步确定G蛋白在调节GPR40介导的ERK1/2的磷酸化中作用，发现Gαi/o抑制剂PTX和Gαq抑制剂FR900359均能显著逆转C17∶0对ERK1/2磷酸化的促进作用（图4）。

3 讨论

游离脂肪酸作为体内重要的营养物质和信号分子，可通过GPCRs参与多种生理途径［27-28］。长链脂肪酸受体GPR40被证明能够促进胰岛素分泌和改善葡萄糖耐量，是非常重要的2型糖尿病靶点受体［29］。目前关于长链脂肪酸激活GPR40的机制研究主要集中在偶数链脂肪酸，有关奇数链脂肪酸C17∶0能否激活GPR40目前尚无研究报道。本研究在体外细胞水平上，通过对多个信号分子指标的检测，初步证实C17∶0可作为GPR40的内源性配体，这为阐明C17∶0发挥调节糖代谢作用的具体分子机制，提供了有力的支持。

配体诱导的受体内吞在GPCRs信号转导的调节中具有重要功能，是介导细胞信号强度和持续时间的关键机制，也是直接反映受体激活的关键因素［30-32］。本研究在对C17∶0介导的GPR40受体内吞情况进行检测后发现：无配体刺激情况下，GPR40-EGFP主要位于细胞膜上，而在C17∶0处理后，GPR40-EGFP受体分布发生变化，集中在了细胞核周围。β-arrestin是一类介导受体脱敏的重要可溶性蛋白质，是GPCRs信号通路的重要调节因子。β-arrestin包括两个成员：β-arrestin1和β-arrestin2。两种亚型在氨基酸序列上高度相似，广泛分布于各个组织中［33］。据报道，β-arrestin2作为支架蛋白分子在β-arrestins依赖性胰岛素信號通路中发挥重要的作用，β-arrestin2可能作为一个潜在的靶分子去应对IR和T2DM［34］。已有研究表明，β-arrestin通常参与到受体的内吞过程中［35］。我们的研究证实了在C17∶0介导的GPR40的内吞中，β-arrestin2被招募到细胞膜上。

Ca2+浓度的变化是细胞内信号转导的重要步骤，本研究结果显示，C17∶0处理细胞后能够促进细胞内钙流的释放。在对其具体机制研究后发现，Gαq抑制剂FR900359处理几乎可完全阻断C17∶0介导的细胞内钙流的产生，而Gαi/o抑制剂PTX预处理，也部分阻断了C17∶0介导的细胞内钙流的活化。ERK1/2是调控细胞生长、分化、增殖和凋亡等生理功能的重要因子。本研究结果发现，C17∶0激活GPR40后可显著促进ERK1/2的磷酸化，而Gαi/o抑制剂PTX和Gαq抑制剂FR900359均能显著逆转C17∶0对ERK1/2磷酸化的促进作用。以上结果表明，C17∶0激活GPR40后介导了Gαq和Gαi/o蛋白双偶联的信号通路。

總之，在本研究中，我们首次探讨了长链脂肪酸C17∶0介导GPR40的信号转导机制，证实了C17∶0可作为内源性配体介导介导GPR40与Gaq和Gai/o蛋白双偶联，激活Ca2+信号通路以及ERK1/2信号级联。本研究结果将有助于进一步阐明奇数链脂肪酸激活GPR40受体的作用机制，也为进一步以奇数链脂肪酸为靶点，开发新型降糖药物提供了新的理论依据。

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收稿日期：中文收稿日期2022-11-06

基金项目：国家自然科学基金地区基金项目（82160156，81960152，82260162），新疆生产建设兵团重点领域科技攻关项目子课题（2021AB028，2022AB022）

作者简介：马丁凌（1996—），女，硕士研究生，专业方向为生物化学与分子生物学。

*通信作者：张君（1979—），男，教授，从事肥胖、炎症及代谢相关性疾病的发病机制研究，e-mail： zhangjunyc@163.com。