静息态罗伊氏乳杆菌代谢功能低聚糖及对食源致病菌的拮抗作用

邹开翔，刘 乐，李新瑞，朱 可，魏 华,，张志鸿,,3,

（1.南昌大学 食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大学重庆研究院，重庆 402660）

抗生素等药物一直被认为是治疗细菌感染的最佳药物，而细菌耐药性是目前全球卫生和食品安全发展的最大威胁之一[1-2]，这主要是抗生素的长期使用导致微生物群的生态位空缺[3]，从而促使强耐药性病原体在这种紊乱的肠道环境中定植，损伤宿主屏障，引起一系列风险[4]。每年耐药细菌感染导致全球约70万 人死亡，估计在2050年将导致1 000多万人死亡[5]。益生菌因能抑制致病菌和调节肠道菌群结构，被认为是潜在“绿色抗生素”[6]。因此，选育具备特定抑菌活性的新型乳酸菌，对于预防和治疗细菌感染具有重大意义[7]。

罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）是一类栖息在鸡、猪、鸟和人类等脊椎动物肠道中的益生乳酸菌[8]，以生物膜的形式定植在宿主[9]，可通过释放短链脂肪酸[10]和细菌素[11]等方式抑制病原体增殖，维持微生物动态平衡，从而保护肠上皮屏障[12]。静息态罗伊氏乳杆菌是指菌株进入静止期，不再生长，但仍具有较强的代谢活性和生物转化能力[13]，作为反应系统中的细胞工厂，相比生长期更容易且更稳定地生产特定单一发酵产物，并实现最大产量[14]，如产广谱抗菌物质Reuterin[15]。

甘油可作为罗伊氏乳杆菌静息状态下的外部氢受体，在辅酶VB12和甘油脱水酶的作用下胞内脱水成为3-羟丙醛[14]。厌氧条件下，3-羟丙醛可进一步通过辅酶NAD＋和氧化还原酶还原为1,3-丙二醇[16]。以3-羟基丙醛单体为转化中心的复杂动态混合产物称为Reuterin[17]。Reuterin可被应用于生物抑菌剂、抗感染治疗剂等。Angiolillo等[18]的研究表明罗伊氏乳杆菌能够在奶酪中产生Reuterin，抑制食源性病原体和腐败细菌的污染，从而显著延长奶酪的货架期。前期研究表明，Reuterin的产量与罗伊氏乳杆菌的生长时期和生长碳源有密切关系[19-20]。

功能性低聚糖是一类不被胃肠道消化吸收但易被肠道乳酸菌利用的碳水化合物[21]。研究表明，一些功能低聚糖具有促进罗伊氏乳杆菌的生长代谢及抑制大肠杆菌的功能[20]。为此，本研究在评价鸡源罗伊氏乳杆菌的生物学活性后，进一步探究功能低聚糖对静息态罗伊氏乳杆菌的代谢、黏附和拮抗食源致病菌的影响。将为开发具备优良抑菌性能的罗伊氏乳杆菌及其在特定条件下的功能开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗伊氏乳杆菌HLRE01和HLRE13分离于当地农贸市场中健康母鸡粪便，其与阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞性李斯特菌CMCC54007和金黄色葡萄球菌CMCC26003等均保藏在食品科学与与资源挖掘全国重点实验室。

MRS培养基 英国Oxoid公司；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培养基、甘油 北京索莱宝生物科技有限公司；葡萄糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、棉子糖 上海源叶生物科技有限公司；抗生素药敏纸片 温州市康泰生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50A型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅医疗生物仪器有限公司；H1650-W型台式离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；Anaerobic IV型多功能厌氧培养箱美国GeneScience公司；PHS-3E pH计 上海伟业仪器厂；DYY-6C凝胶水平电泳仪 北京市六一仪器厂；电子天平 德国Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 16S rDNA序列同源性分析

根据前期发表文献[8]，采用选择培养基LRIM从健康母鸡粪便中筛选罗伊氏乳杆菌，并对筛选到的菌株进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），反应体系为DNA 1 μL、2×TaqPCR MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL，最终体积为20 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s和72 ℃延伸90 s，共30 个循环，接着72 ℃终延伸10 min。其中DNA采用热裂解法获取，16S rRNA引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.2 静息态罗伊氏乳杆菌的制备

取新鲜罗伊氏菌液以1%接种量接种于MRS培养基，反应器中注入充足的氮气以维持厌氧环境，在37 ℃不控制pH值的情况下静置培养24 h，在10 mL离心管中将静息态细菌颗粒在4 ℃、6 000 r/min洗涤并重新悬浮在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中获得静息态菌体[22]。对制备获得的静息态罗伊氏乳杆菌进行功能评价。

1.3.3 静息态罗伊氏乳杆菌功能评价

1.3.3.1 耐酸耐胆盐能力

将静息态罗伊氏乳杆菌菌体重悬于PBS中，然后以1%接种量接种于pH值为2.0和3.0的MRS培养基中，37 ℃条件下厌氧培养，计算0 h和3 h活菌数，测定其存活率；将静息态罗伊氏乳杆菌重悬菌体接种于含0.15%和0.30%牛胆盐的MRS培养液中，37 ℃条件下厌氧培养，计算0 h和6 h的活菌数，测定其存活率。菌株存活率计算如式（1）所示：

式中：N1和N0分别为处理后和处理前的活菌数。

1.3.3.2 抗生素敏感性

采用纸片扩散法测定菌株的抗生素敏感性[23]。将静息态罗伊氏乳杆菌菌液均匀涂布在MRS固体平板上，接着将药敏纸片轻轻贴附平板上，于37 ℃条件下厌氧孵育24 h，测量其直径。抗生素敏感性分为耐药、中度敏感和敏感。

1.3.3.3 利用功能低聚糖代谢能力评价

参考前期文献[24]，配制MRS基底培养基（每800 mL体积中含10.0 g胰蛋白胨、5.0 g牛肉膏、5.0 g酵母提取物、3.0 g氯化铵、4.0 g磷酸氢二钾、2.6 g磷酸二氢钾、0.102 g七水硫酸镁、0.05 g四水硫酸锰、0.5 g半胱氨酸和1.0 g吐温-80，调pH 6.2±0.1），分别添加低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、棉子糖和葡萄糖溶液至终质量分数为2%，获得改良MRS培养基，其中葡萄糖作为对照。接种静息态罗伊氏乳杆菌菌液至改良培养基，厌氧培养24 h，监测其生长和pH值变化。

1.3.3.4 表面疏水性

参考Hernandez等[25]方法并稍加改进，测定静息态罗伊氏乳杆菌在不同改良培养基中的疏水性。取分别添加低聚半乳糖、棉子糖和葡萄糖的改良MRS培养基培养后的菌体，重悬在PBS中并调整到108CFU/mL测吸光度（A0），然后在3 mL菌悬液中加入1 mL二甲苯，涡旋1 min，于37 ℃孵育30 min。在600 nm波长处测定水相的吸光度（A1）。疏水性计算如式（2）所示：

式中：A0和A1分别为处理前后水相的吸光度。

1.3.3.5 细胞上黏附性能

取2 mL Caco-2细胞悬液于6 孔细胞培养板，37 ℃、5% CO2条件下培养18 h至形成单细胞层，弃细胞培养液，再用2 mL Hanks缓冲液洗涤细胞2 次，接着每孔加入2 mL含108CFU/mL静息态罗伊氏乳杆菌的不含双抗DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2条件下孵育2 h。清洗掉未黏附的细菌，接着在细胞培养孔中添加400 μL消化液，5 min后再添加600 μL不含双抗的DMEM培养基，充分吹打至细胞完全脱落。按式（3）计算细胞悬液中活菌数：

1.3.3.6 产广谱抗菌Reuterin的能力与定量

取分别添加棉子糖和葡萄糖的改良MRS培养基培养后的108CFU/mL静息态罗伊氏乳杆菌，重悬于250 mmol/L甘油中，在37 ℃条件下厌氧孵育2 h，12 000 r/min离心5 min，收集上清液，经0.22 μm滤膜过滤得到Reuterin溶液[20]。取100 μL上述滤液，加入75 μL 0.01 mol/L的色氨酸溶液（溶于0.05 mol/L盐酸中）和300 μL浓盐酸，在37 ℃孵育30 min后，于560 nm波长处测定紫色络合物的OD值，蒸馏水相对滤液为阴性对照。利用不同质量浓度（0、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL）的丙烯醛溶液进行上述反应，以质量浓度为横坐标、OD560nm为纵坐标绘制标准曲线，用于对Reuterin的定量分析。

1.3.3.7 静息态罗伊氏乳杆菌发酵棉子糖后的抑菌能力

采用Gharbi等[26]的牛津杯法测定具优良益生菌潜力菌株的抑菌能力。将指示菌株（阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞性李斯特菌CMCC54007和金黄色葡萄球菌CMCC26003）接种至LB液体培养基中，过夜培养，接着蘸取菌液均匀划线于LB固体平板上。在含有50 mmol/L甘油和2%棉子糖的改良MRS培养基中培养罗伊氏乳杆菌，取200 μL培养至静息态的罗伊氏乳杆菌发酵上清液于牛津杯中，无甘油组为对照。37 ℃培养12 h后，测量抑菌圈直径。

1.3.3.8 静息态罗伊氏乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌的黏附

依照Singh等[27]报道，采用竞争、排斥和置换实验在Caco-2细胞上评估罗伊氏乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌黏附的能力。首先，采用含棉子糖的培养基培养并获得108CFU/mL的静息态罗伊氏乳杆菌，采用LB培养基培养并获得108CFU/mL金黄色葡萄球菌并清洗2 遍。在竞争实验中，用含250 mmol/L甘油的DMEM重悬罗伊氏乳杆菌和金黄色葡萄球菌，取2 mL加至6 孔板中共孵育2 h；在排斥实验中，加入2 mL含250 mmol/L甘油的罗伊氏乳杆菌悬液，与单层细胞孵育1 h，再用Hanks缓冲液洗涤3 次；然后加入2 mL金黄色葡萄球菌悬液，再孵育1 h。在置换实验中，细菌孵育顺序和排斥模式相反。无甘油组作为对照，待细胞培养结束并消化后，将混合液转移至离心管中，进行平板计数，测定黏附抑制率。

1.3.3.9 静息态罗伊氏乳杆菌在发酵牛奶中抑制金黄色葡萄球菌的能力

以脱脂奶粉为原料，配制10%的脱脂乳并进行灭菌。采用含棉子糖的改良培养基培养罗伊氏乳杆菌，接种静息态罗伊氏乳杆菌至无菌脱脂乳中，终浓度为107～108CFU/mL；再接种金黄色葡萄球于无菌脱脂乳中，终浓度为102～103CFU/mL，37 ℃静置培养24 h。其中，脱脂乳中甘油浓度为250 mmol/L，单一接种菌株作为对照。在不同孵育时间动态监测pH值和菌株生长情况。

1.4 统计与分析

2 结果与分析

2.1 16S rDNA序列同源性分析

将测序所得序列与NCBI数据库中已知罗伊氏乳杆菌进行比对，根据相似性初步鉴定出两株罗伊氏乳杆菌。进一步对该菌株进行序列同源性分析，并构建其16S rDNA基因序列的系统发育树，结果如图1所示，两株编号为HLRE01和HLRE13的菌株分别与罗伊氏乳杆菌序列同源性达99%和100%，判定该菌株为罗伊氏乳杆菌。

图1 基于16S rDNA基因序列构建罗伊氏乳杆菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of L.reuteri based on 16S rDNA gene sequences

2.2 耐酸耐胆盐能力

菌株具有耐酸耐胆盐能力是其通过胃肠道环境并发挥益生功能的重要前提。如图2A所示，2 株静息态罗伊氏乳杆菌在pH 3.0条件下培养3 h后，存活率可超过95%；当pH值降为2.0时，存活率均显著下降（P＜0.001），但仍可达80%以上，说明其耐酸能力较好，且该结果与朱振军等[28]筛选的大部分罗伊氏乳杆菌耐受性结果一致。另外，胆盐质量分数由0.15%变为0.30%时，HLRE01和HLRE13孵育6 h的存活率分别由98.67%和84.78%变为70.54%和65.10%（P＜0.001），耐受性较好，且HLRE01优于HLRE13与崔鹏月等[29]报道的罗伊氏乳杆菌WX-94耐受能力。综上说明HLRE01和HLRE13均具有良好的耐受胃肠道环境的潜力。

图2 罗伊氏乳杆菌对酸（A）和胆盐（B）环境的耐受性Fig.2 Resistance of L.reuteri to acids (A) and bile salts (B)

2.3 抗生素敏感性

抗生素敏感性是菌株安全性评价的一项重要指标。本研究发现两株罗伊氏乳杆菌对不同抗生素的敏感性均存在差异（表1），其中HLRE01对大部分抗生素敏感，对红霉素、万古霉素、克林霉素、四环素和环丙沙星表现为抗性，HLRE13同样对大部分抗生素敏感，只对万古霉素、四环素和环丙沙星具有抗性。说明该菌株具有良好的安全性，这些结果与李一娟等[8]关于罗伊氏乳杆菌的抗生素敏感性研究具有类似效果。

2.4 功能低聚糖对罗伊氏乳杆菌生长代谢的影响

乳酸菌在肠道中能利用不同功能性低聚糖，其代谢水平可能影响着菌株在宿主体内的益生性能[30-31]。由图3A可知，HLRE01利用几种低聚糖代谢的特征明显不同，棉子糖、低聚半乳糖及低聚异麦芽糖能促进其生长，且棉子糖作用最强，但依然弱于单糖葡萄糖，而低聚木糖几乎无促进生长作用。HLRE13具有类似的代谢特征，但其利用低聚异麦芽糖的能力优于HLRE01（图3B）。由图3C可知，发酵时间达24 h，棉子糖是最有效促进罗伊氏乳杆菌生长代谢的低聚糖，其次是低聚半乳糖，而低聚木糖几乎无促进作用，这可能是因为菌株不含分解低聚木糖的相关酶，图3D也证实了该结论，棉子糖组发酵液最终的pH值最低，而低聚木糖组发酵液最终的pH值最高，这可能是因为菌株代谢越强，发酵液中积累有机酸越多而导致。

图3 不同功能低聚糖对罗伊氏乳杆菌代谢的影响Fig.3 Effect of different functional oligosaccharides on the metabolism of L.reuteri

2.5 功能低聚糖代谢改善罗伊氏乳杆菌的黏附能力

乳酸菌利用不同碳水化合物代谢，菌株表面疏水性会存在差异，进而影响菌株在细胞上的黏附能力[25]。如图4A所示，HLRE01和HLRE13利用低聚糖代谢后，表面疏水性均显著高于对照葡萄糖组（P＜0.01，P＜0.000 1），且HLRE13利用低聚半乳糖和棉子糖代谢后疏水性提高更加明显，相比葡萄糖组分别提高了15.15%和18.62%。从图4B可知，菌株利用功能低聚糖发酵后在Caco-2细胞上黏附能力也提高，其中HLRE01利用低聚半乳糖和棉子糖发酵后的黏附率分别为4.65%和8.36%，后者显著高于葡萄糖组（P＜0.05），而HLRE13利用低聚糖发酵后的黏附率升高更明显，其中利用棉子糖发酵后的黏附率可达26.86%，显著高于葡萄糖组的7.53%（P＜0.000 1）。综上结果，表明棉子糖是提高罗伊氏乳杆菌表面疏水性和黏附能力的最佳功能低聚糖，尤其是针对HLRE13菌株；另外，菌株的黏附性能与表面疏水性存在正相关，证实了前期报道的疏水性是反映益生菌高黏附特性重要指标的结论[32]。下一步，选择棉子糖和HLRE13为后续实验的发酵碳源和菌株。

图4 功能低聚糖对罗伊氏乳杆菌疏水性（A）和黏附率（B）的影响Fig.4 Effect of functional oligosaccharides on the hydrophobicity (A) and adhesion rate (B) of L.reuteri

2.6 静息态罗伊氏乳杆菌产Reuterin的能力及抑菌活性

利用甘油发酵产广谱抗菌的Reuterin是含pdu基因簇罗伊氏乳杆菌特有的特征[8]，具有良好黏附肠上皮细胞能力的HLRE13是否产Reuterin并抑致致病菌值得进一步探究。依据丙烯醛标准曲线（Y=0.831 8X＋0.044 98，R2=0.998；Y为OD560nm，X为丙烯醛质量浓度（g/L）），可知HLRE13能利用甘油发酵产Reuterin，且利用棉子糖发酵获得的静息态细胞所产Reuterin（（1.34±0.03）g/L）高于葡萄糖组（（0.23±0.01）g/L）（图5A），说明其携带相关基因簇。另外，比较发酵液中含甘油和不含甘油组发酵上清对致病菌的抑制，发现添加甘油的抑菌活力高于不含甘油的组，如单核细胞性李斯特菌抑菌圈由（18.18±0.57）mm提高到（19.35±0.13）mm，而阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈显著提高（P＜0.001；图5B），这一结果同样说明了Reuterin的产生，也证实了前期的实验结果[8]。

2.7 静息态罗伊氏乳杆菌抑制金黄色葡萄球菌的黏附

上述研究发现，金黄色葡萄球菌对HLRE13所产Reuterin最敏感，其在细胞上的黏附是否也被抑制有待进一步研究。由图6可知，静息态罗伊氏乳杆菌HLRE13能通过竞争、排斥和替换方式抑制金黄色葡萄球菌在Caco-2细胞上的黏附，且排斥方式的黏附抑制率最低，只有9.87%。然而，当培养液中添加甘油后，3 种方式的抑制率均得到提高，且排斥方式的抑制率提高最多，达41.67%。不同的竞争模型可以模拟乳酸菌和病原体在上皮细胞上竞争的机制，其中竞争抑制主要是竞争营养和定植生态位点的抑制方式，排斥抑制主要是不允许后续菌株黏附定植的方式，而替代抑制主要是通过产抗菌、抗黏附物质而抑制的方式，本研究发现不同抑制方式的抑制率不同，可能和它们的作用机制存在差异有关[33]。

2.8 发酵乳中罗伊氏乳杆菌和金黄色葡萄球菌的相互作用

选取金黄色葡萄球菌容易污染的乳制品作为载体，进一步评价HLRE13在共发酵过程中对金黄色葡萄球菌的抑制。如图7A所示，金黄色葡萄球菌在牛奶中单独发酵时，生长良好，且在12 h达到稳定期并维持在107～108CFU/mL；当金黄色葡萄球菌与HLRE13在牛奶中共发酵时，金黄色葡萄球菌的活菌数只能在18 h到达最大，约106CFU/mL，且在24 h降为103CFU/mL，说明其生长受到抑制；当共发酵模式中添加甘油后，金黄色葡萄球菌的生长受到明显抑制，活菌数仅在6 h有微弱上升后便一直下降，这主要是Reuterin发挥了抑制作用，与前面结果一致。另外，HLRE13在单独发酵和共发酵过程中，生长几乎不受影响，均保持良好生长态势，且添加甘油的共发酵组中活菌数显著高于其他组（P＜0.000 1；图7B），说明罗伊氏乳杆菌HLRE13能有效预防金黄色葡萄球菌在牛奶发酵过程中的污染，且不受金黄色葡萄球菌和Reuterin的影响，该结果与Ortiz-Rivera等[34]发现的罗伊氏乳杆菌产Reuterin可抑制病原菌的污染并延长发酵乳制品货架期结果类似。

图7 牛奶共发酵过程中活菌数变化Fig.7 Changes in viable counts of S.aureus and L.reuteri during co-culture in milk

3 结论

罗伊氏乳杆菌是一类广泛存在于脊椎动物体内的乳酸菌，其能够特异性的代谢产广谱抗菌的Reuterin[20]。静息态罗伊氏乳杆菌因其特殊的代谢活性和生物转化能力，可作为研究特定代谢产物合成的有效工具[35]。本研究从健康母鸡新鲜粪便中定向筛选到2 株罗伊氏乳杆菌HLRE01和HLRE13，进一步制备静息态菌体，并发现其能耐受酸和胆盐等胃肠道环境；体外发酵实验证实其能够代谢不同功能低聚糖，且利用棉子糖发酵能显著提高罗伊氏乳杆菌代谢能力、表面疏水性、黏附率、产Reuterin水平及抑制致病菌的能力；另外，甘油能促进静息态罗伊氏乳杆菌HLRE13以多种方式抑制金黄色葡萄球菌在细胞上的黏附，且在牛奶共发酵体系中促进菌株产Reuterin并拮抗金黄色葡萄球菌，而不影响自身的生长代谢。本研究解析的静息态罗伊氏乳杆菌是能耐受胃肠道环境、黏附肠上皮细胞、产广谱抗菌Reuterin并拮抗食源致病菌的菌株，将为丰富我国特色乳酸菌资源及罗伊氏乳杆菌在特定状态下的功能研究奠定基础。