经典名方芍药甘草汤古代与现代煎煮方法的差异性分析△

高永坚，曾杉，林碧珊，陈伟彦，彭丹丹，董家铭，王艳霞

国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305

经典名方疗效确切，传承至今仍广泛应用，具有明显的特色与优势。为支持经典名方的研究及创新开发，促使其转化成质量高、疗效好的经典产品，国家相关部门相继出台了《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》[1]和《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[2]（以下简称《指导原则》）。经典名方芍药甘草汤出自东汉张仲景[3]的《伤寒论》，其中记载“伤寒脉浮，自出汗，小便数，心烦，微恶寒，脚挛急……若厥愈足温者，更作芍药甘草汤与之，其脚即伸”，原处方为“白芍药、甘草（炙，各四两），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分温再服”。张仲景的芍药甘草汤被历代医家推崇，其加减组方一直沿用至今，是国家中医药管理局公布的《古代经典名方关键信息表（25首方剂）》[4]中的经典名方之一。该方由白芍和炙甘草组成，白芍酸苦微寒，益阴养血；炙甘草甘温，补中缓急。两药合用，有滋阴血、缓挛急的作用，临床上用芍药甘草汤治疗肌肉痉挛、关节拘急、疼痛均有较好疗效。根据《经方本原剂量问题研究》[5]中东汉时期度量衡换算标准，一两约为现代13.8 g，一升为200 mL，一合为20 mL。若按古代煎煮方法，则取白芍药、炒甘草各55.2 g，加水600 mL，煮取至300 mL 的药液，提取过程中饮片利用率低，致使大量饮片被浪费。而现代临床应用多参照《医疗机构中药煎药室管理规范》[6]，加水煎煮2次，可将饮片中有效成分充分提取，节省资源，降低成本。古今2种煎煮方法的制备工艺存在较大差异，因此本研究以干膏率、指纹图谱及有效成分含量为考察指标，进一步进行对比研究，优化本方的制备工艺。

1 材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；MS105DU 型十万分之一天平、AL104 型万分之一天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品芍药苷（批号：110736-202145，纯度：94.6%）、没食子酸（批号：110831-201605，纯度：90.8%）、甘草苷（批号：111610-201607，纯度：93.1%）、苯甲酸（批号：100419-201703，纯度：99.9%）、甘草酸铵（批号：110731-201720，纯度：97.7%）均购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷（批号：8619，纯度：95.0%）、芹糖甘草苷（批号：6969，纯度：98.0%）、异甘草苷（批号：6387，纯度：98.0%）、甘草素（批号：4280，纯度：98.0%）、苯甲酰芍药苷（批号：4633，纯度：95.0%）均购自成都德思特生物有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。白芍（购自安徽省亳州市，批号分别为BS301、BS302、BS303）、甘草（购自甘肃省定西市，批号分别为GC301、GC302、GC303）按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版[7]检验均合格。白芍饮片按《中国药典》2020 年版[7]炮制而得，炒甘草饮片按《上海市中药饮片炮制规范》2018 年版[8]炮制而得。

2 方法与结果

2.1 古代方法煎煮

取白芍、炒甘草各55.2 g，加入陶瓷壶中，加水600 mL，使用武火500 W 煮沸后，调至文火200 W煎煮30 min，350目筛趁热滤过，得煎液。

2.2 现代方法煎煮

按《医疗机构中药煎药室管理规范》[6]方法煎煮，得煎液。

2.3 特征图谱测定

2.3.1 供试品溶液的制备 取相当于饮片量1 g 的古代煎煮方法制备的芍药甘草汤煎液，精密称定，置50 mL量瓶中，加水至约15 g，再加甲醇适量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 取没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、苯甲酰芍药苷、甘草素、异甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，分别加70%甲醇制成质量浓度为80 μg·mL-1的混合溶液。

2.3.3 色谱条件 Waters Cortecs T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.6 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～4 min，5%A；4～15 min，5%～36%A；15～21 min，36%～100%A；21～25 min，100%～5%A），流速为0.25 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；进样体积为1 µL。

2.3.4 专属性考察 精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液与空白溶剂各1 μL 注入液相色谱仪测定，结果表明，在空白溶剂色谱相应位置上无对应色谱峰出现，在供试品溶液色谱相应位置上与对照品色谱相应位置上的色谱峰都相对应，说明该方法专属性较好（图1）。

2.3.5 精密度考察 取2 种方法制备的煎液适量，按2.3.1项下方法制备供试品溶液，按2.3.3项下色谱条件连续进样6 次，所得色谱图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性考察 取2 种方法制备的煎液适量，按2.3.1 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.3.3 项下色谱条件测定，所得色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性考察 取2 种方法制备的煎液适量，按2.3.1项下方法制备供试品溶液，按2.3.3项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h测定，所得色图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.8 古代煎煮方法和现代煎煮方法的图谱分析 按2.3.1 项下方法制备供试品溶液，按2.3.3项下色谱条件进行测定，对比古代煎煮方法和现代煎煮方法的液相色谱图（图2）。在含相同饮片量的情况下，2 种煎煮方法所得煎液色谱图的色谱峰数目基本一致，无明显差异。

图2 芍药甘草汤古代煎煮方法和现代煎煮方法特征图谱

2.3.9 特征图谱的建立与共有峰指认 将2 种煎煮方法的芍药甘草汤色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），进行多点校正，以古代煎煮方法的特征图谱为参照图谱，建立芍药甘草汤2 种煎煮方法的对照特征图谱。由于1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖峰的峰分离效果差且峰面积小，故暂不考虑此峰。利用对照品比对法匹配了没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、异甘草苷、甘草素、苯甲酰芍药苷、甘草酸10 个共有峰。2 种煎煮方法的特征图谱相似度均为0.996，大于0.99。

2.3.10 相对保留时间、相对峰面积及峰面积分析 以峰3芍药苷为参照峰（S峰），2种煎煮方法的芍药甘草汤共有峰的相对保留时间和相对峰面积结果见表1，相对保留时间的RSD 均小于1.0%，表明各共有峰具有较高的相似性；在含相同饮片量的前提下，对比2 种煎煮方法所得煎液的相对峰面积，结果现代煎煮方法与古代煎煮方法的相对峰面积的RSD 均小于1.0%，表明其相对峰面积结果差异较小。但是，综合分析2 种煎煮方法的色谱峰峰面积（表2），现代煎煮方法的主要色谱峰峰面积均在古代煎煮方法的2 倍以上，表明现代煎煮方法所得煎液中各化合物的含量高于古代煎煮方法，饮片利用率较高，现代煎煮方法明显优于古代煎煮方法。

表1 芍药甘草汤古代煎煮方法与现代煎煮方法相对保留时间和相对峰面积

表2 芍药甘草汤古代煎煮方法与现代煎煮方法共有峰的峰面积

2.4 含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备 取相当于饮片量1 g 的芍药甘草汤煎液，精密称定，置于50 mL 量瓶中，加水至约15 g，再加甲醇适量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.2 对照品溶液的制备 取芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为100、50、100 μg·mL-1的混合溶液，即得。

2.4.3 色谱条件 芍药苷、甘草苷、甘草酸含量测定采用2.3.3项下色谱条件。

2.4.4 专属性考察 精密吸取供试品溶液、混合对照品溶液与空白溶剂各1 μL，注入液相色谱仪测定，结果见图3。结果表明，与空白溶剂相比，在供试品溶液色谱相应位置上无对应色谱峰出现，说明该方法专属性较好。

图3 芍药甘草汤与混合对照品HPLC图

2.4.5 线性关系考察 取芍药苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为400 μg·mL-1的对照品储备液；取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为400 μg·mL-1的对照品储备液；取甘草苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成质量浓度为200 μg·mL-1的对照品储备液。分别取芍药苷对照品储备液和甘草酸铵对照品储备液稀释成质量浓度为400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg·mL-1的溶液；取甘草苷对照品储备液稀释成质量浓度为200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg·mL-1的溶液。按2.4.3项下色谱条件测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得芍药苷、甘草苷、甘草酸线性回归方程分别为Y=4 990.9X-2 204.9（r=0.999 9）、Y=7 892.1X+3 833.3（r=1.000 0）、Y=3301X+930.56（r=1.000 0），结果表明芍药苷、甘草苷、甘草酸在一定质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.6 精密度试验 取2.1 项下制备的煎液适量，按2.4.1 项下方法制备供试品溶液，按2.4.3 项下色谱条件连续进样6 次，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD 分别为1.45%、1.70%、0.97%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 取2.1 项下制备的煎液适量，按2.4.1项下方法制备供试品溶液，按2.4.3项下色谱条件分别于制备后0、3、6、9、12、24、36、48 h进样，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为1.63%、1.65%、1.69%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 取2.1 项下制备的煎液适量，按2.4.1 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.4.3 项下色谱条件测定，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸质量分数的RSD 分别为0.59%、0.69%、1.75%，表明该方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 精密称定已知含量的芍药甘草汤煎液0.60、1.30、2.10 g，各平行处理3 份，分别按1∶1加入低（50%）、中（100%）、高（150%）质量浓度的芍药苷、甘草苷、甘草酸铵对照品溶液，按2.4.1 项下供试品溶液的制备方法处理后按2.4.3项下色谱条件进行测定，计算芍药苷、甘草苷、甘草酸的加样回收率分别为102.35%、97.84%、100.76%，RSD分别为1.34%、1.38%、1.38%，表明该方法准确度良好，结果见表3。

表3 芍药甘草汤中3个成分加样回收率试验结果 mg

2.4.10 样品测定 取2 种方法制备的煎液适量，按2.4.1项下方法制备供试品溶液，参照2.4.3项下色谱条件测定，测得古代和现代煎煮方法煎液的芍药苷、甘草苷、甘草酸处方量见表4，处方中芍药苷、甘草苷、甘草酸处方量现代煎煮方法约为古代煎煮方法的2 倍。结果表明，现代煎煮方法的饮片利用率明显高于古代煎煮方法。

表4 芍药甘草汤古代和现代煎煮3个成分处方量

2.5 干膏率

分别取2 种煎煮方法制得的煎液约10 g，精密称定，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，冷却0.5 h后，精密称定质量，按公式（1）计算固含率，按公式（2）计算干膏率。

结果表明，芍药甘草汤现代煎煮方法的干膏率明显高于古代煎煮方法，且现代煎煮方法干膏率约为古代煎煮方法的2倍（表5）。

表5 芍药甘草汤古代和现代煎煮方法的干膏量和干膏率

3 讨论

经典名方芍药甘草汤由白芍和炒甘草2 味中药组成，虽然药味较少，但其化学成分复杂，不同煎煮方法可能导致复方中有效成分含量发生变化，进而影响复方功效及临床疗效，因此考察煎煮方法尤为重要。芍药甘草汤含芍药苷、甘草苷、甘草酸和多糖等成分，芍药苷为常用中药白芍的主要有效成分，是一种单萜类糖苷化合物，具有抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载、保护脑血管系统、抑制肿瘤细胞、调节免疫作用等功效[9]；甘草苷和甘草酸是甘草的主要有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和调节免疫作用[10]。本研究以干膏率、有效成分含量及指纹图谱对芍药甘草汤的2 种煎煮方法进行差异性分析，推测产生差异的原因包括：1）白芍和甘草在处方中的剂量都比较大，按古代煎煮方法，煎煮水量较少、时间较短，不能将有效成分充分提取出来。2）按现代方法进行煎煮所得处方的干膏率、有效成分含量是古代煎煮方法的2 倍。芍药甘草汤的现代煎煮方法能较好地提取芍药苷、甘草苷、甘草酸成分，其饮片的利用率高于古代煎煮方法，可以避免药材的大量浪费。

芍药甘草汤原文记载为“以水三升，煮取一升五合，去滓”。结合《指导原则》[2]、《医疗机构中药煎药室管理规范》[6]及具体情况，有必要合理确定制备工艺。芍药甘草汤的现代煎煮方法能较好地提取芍药苷和甘草苷等有效成分，且现代煎煮方法更易贴合工业生产实际情况，更适于制剂的工业转化。综合考虑，现代煎煮方法可能更适用于芍药甘草汤的制剂开发。

综上所述，本研究结合《指导原则》[2]，以制剂与基准样品的质量基本一致为目标，从干膏率、有效成分含量、指纹图谱角度对经典名方芍药甘草汤的2 种煎煮方法差异进行探讨分析，以期为煎煮工艺不明确的经典名方物质基准制备及制剂生产研究提供参考。