基于“辨状论质”结合熵权法的厚朴药材质量等级研究△

梁敬妮，李阳，由金文，杨瑞琦，李佳慧，崔阳，王亚顺，邹慧琴*，闫永红*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.湖北省农业科学院 中药材研究所，湖北 恩施 445000；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥湿消痰、下气除满的功效[1]。现代研究表明，酚类和挥发油类是厚朴的主要药效成分[2]。现代药理研究表明，厚朴具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、心肌保护、脑缺血保护、抗焦虑、抗抑郁等广泛的生物活性[3-8]。在《七十六种药材商品规格标准》[9]（以下简称原标准）中，依据产地和药用部位的不同将厚朴划分为“温朴筒朴”（产于浙江的干皮）、“川朴筒朴”（产于四川的干皮）、“蔸朴”（靠近根部的干皮和根皮）、“耳朴”（靠近根部的干皮）和“根朴”5 种商品规格，其中在“川朴筒朴”规格下根据长度和质量的不同划分为4 个等级。在市场流通中，主要以“辨状论质”的经验鉴别对厚朴进行等级划分，即通过外部性状特征鉴别质量优劣，因受产地、树龄差异性大、加工随意性强等自然和人为因素的影响，相同等级的厚朴药材质量参差不齐。“辨状论质”是中药传统经验鉴别的精髓[10]，但其主观性较强，而现代理化鉴别具有客观性和准确性，对传统性状鉴别结果与现代理化鉴别结果进行相关性研究可为“辨状论质”提供科学依据。

近年来，信息熵赋权法在医药卫生行业应用广泛，其权重依据客观的实验数据，是研究解决多个不相容问题和方法的有力工具，能够实现多目标决策分析。这与中药多指标质量综合评价思路相符合，能真实地反映客观规律[11]，目前已经应用于白芷[12]、当归[13]、羌活[14]等的质量评价中。

研究表明，不同产地的厚朴药材质量差异较大[15]，有必要按产地划分厚朴药材的商品规格。另外，经市场调研发现，市售厚朴多为“筒朴”干皮，其他规格极少见，故本研究以“川朴筒朴”为研究对象，将可量化的外观性状指标与内在质量指标相结合，采用统计学、化学计量学等方法，探究厚朴药材外观性状与有效成分的相关性，建立“川朴筒朴”的质量等级标准，为厚朴药材综合质量评价提供参考。

1 材料

UltiMate3000 型高效液相色谱仪、TRACE GC ULTRA 型气相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；FW-135 型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；BS-124S 型电子分析天平（德国Sartorius公司）。

对照品厚朴酚（批号：KS0912CB14）、和厚朴酚（批号：Z20A6L1）、β-桉叶醇（批号：P18M8F3 2040）纯度均≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司；色谱纯甲醇、乙酸乙酯（美国Fisher 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

本研究中厚朴均为已知树龄、自然干燥、未经发汗的自采药材，所有样品经北京中医药大学中药资源与鉴定系闫永红教授鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴M.officinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮。a1～a16 树龄为25 年，b1～b13 树龄为20年，c1～c8树龄为15年，d1～d5树龄为20年。

2 方法与结果

2.1 外观性状

对42 批厚朴药材的长度和质量进行测定，鉴于原标准规定一等“川朴筒朴”长度为40～43 cm，因此以40 cm 作为标准对质量进行换算，即每40 cm“川朴筒朴”的质量为单位质量；取厚朴药材，将断面修剪平整，纵向每2 cm 取1 个点，用游标卡尺测量厚度，取平均值，测定结果见表1。

表1 厚朴外观性状指标测量结果

2.2 厚朴酚与和厚朴酚质量分数测定

按《中华人民共和国药典》（以下简称为《中国药典》）2020 年版[1]色谱条件进行厚朴酚与和厚朴酚质量分数测定。

2.3 β-桉叶醇的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 取β-桉叶醇对照品，精密称定，加入乙酸乙酯制成质量浓度为0.818 4 mg·mL-1的β-桉叶醇溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取样品粉末（过二号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯25 mL，密塞，称定质量，静置1 h，超声处理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，加入乙酸乙酯补足减失的质量，摇匀，滤过，即为供试品溶液。

2.3.3 色谱条件 HP-5 毛细管色谱柱（30 m×320 μm×0.25 μm），进样口温度为250 ℃，检测器温度为250 ℃；载气为氢气；升温程序：初始120 ℃保持2 min，5 ℃·min-1升至240 ℃，保持5 min；流速为1 mL·min-1；进样量为1 μL；分流比为10∶1。

2.3.4 方法学考察 精密吸取2.3.1 项下对照品溶液，配制成系列质量浓度的对照品溶液，按2.3.3项下色谱条件测定其峰面积，分别以质量浓度为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y=7 531 677.5X+41 526.2（r=0.999 9）。结果表明，β-桉叶醇质量浓度为0.005 115～0.818 400 mg·mL-1时与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取同一样品溶液1 μL，连续进样6 次，按2.3.3项下色谱方法测定，计算β-桉叶醇色谱峰面积RSD为1.55%，表明仪器精密度良好。

精密称取同一样品粉末6份，按2.3.2项下供试品制备方法平行制备，分别进样，按2.3.3项下色谱方法测定峰面积，计算β-桉叶醇含量RSD为1.05%，表明该方法重复性良好。

取同一样品粉末，精密称定，按2.3.2项下供试品溶液制备方法制备，分别于放置0、2、4、8、12、24 h后进样，按2.3.3项下色谱方法测定峰面积，计算其RSD 为1.70%，表明供试品溶液在24 h 之内稳定。

取已知含量的样品粉末6 份，每份1 g，精密称定，分别加入等量的β-桉叶醇对照品溶液，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.3.3项下色谱方法测定，计算其回收率均值为100.82%，RSD 为1.98%，符合要求。

2.3.5 样品β-桉叶醇质量分数测定 按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.3 项下色谱条件进样2 次，计算样品中β-桉叶醇的含量，取平均值。

2.4 信息熵权法计算综合评分

信息熵权法是将每个评价指标作为1 个随机变量，计算该指标的信息熵。其取值变异程度越大，指标越有序，信息熵就越小，说明信息增益越大，发生的概率越大，不确定性越小，该指标就越重要；反之，该指标就越不重要。信息熵权法的计算步骤：1）建立原始评价指标矩阵(Xij)mn：

2）将原始数据矩阵(Xij)mn转换为概率矩阵(Pij)mn：

3）计算信息熵（Hi）：

4）计算各指标的熵权系数（Wi）：

其中，Xij表示第j次试验时第i个评价指标的取值，i=1、2、3……m；j=1、2、3……n。Pij表示第j次试验在i指标下的概率。

5）综合评分的计算：按公式（1）计算厚朴药材化学成分含量综合评分，结果见表2。

表2 厚朴内在成分指标及综合评分

综合评分=厚朴酚质量分数×W厚朴酚+和厚朴酚质量分数×W和厚朴酚+β-桉叶醇质量分数×Wβ-桉叶醇（1）

2.5 相关性分析

采用SPSS 26.0 统计软件对厚朴酚质量分数、和厚朴酚质量分数、β-桉叶醇质量分数、综合评分、厚度、单位质量6 个指标进行Spearman 相关分析，见表3。相关性分析结果显示，厚朴酚质量分数与厚度、单位质量呈非常显著正相关（P<0.01）；和厚朴酚质量分数与单位质量呈非常显著正相关（P<0.01）；β-桉叶醇质量分数与厚度呈非常显著正相关（P<0.01），与单位质量呈显著正相关（P<0.05）；综合评分与单位质量、厚度均呈非常显著正相关（P<0.01）。此外，从表3 还可以看出，单位质量与厚度呈非常显著正相关（P<0.01），各成分质量分数之间也具有一定的正相关关系，厚朴酚质量分数与β-桉叶醇质量分数具有非常显著正相关关系（P<0.01），与和厚朴酚质量分数具有显著正相关关系（P<0.05）。这说明厚朴皮越厚、质量越大、油性越大，厚朴内在有效成分和厚朴酚、厚朴酚质量分数越高，厚朴质量越好，阐明了传统性状鉴别中认为厚朴以“皮厚、油润”为优的科学内涵。

表3 厚朴外观性状与内在指标间的相关性分析

2.6 “川朴筒朴”等级划分

2.6.1 聚类分析 通过对42 批“川朴筒朴”的成分含量测定发现，有12 批样品的厚朴酚及和厚朴酚总量低于《中国药典》2020 年版规定的2.0%。因此，本研究运用SPSS 26.0 软件，以外在性状指标（厚度、单位质量）和内在成分含量的综合评分为变量，采用离差平方和（Ward）法对成分含量符合《中国药典》2020 年版规定的30 批“川朴筒朴”进行系统聚类分析，以对其进行等级划分，聚类分析结果见图1。从图1 可以看出，当平方欧氏距离为5时，30 批“川朴筒朴”分为3 类，其中样品编号为a1～a7的样品聚为第1类，编号为a8～a14和b1的样品聚为第2类，剩余15批样品聚为第3类。

图1 30批“川朴筒朴”聚类分析图

2.6.2 主成分分析 以标准化后的厚度、单位质量、厚朴酚质量分数、和厚朴酚质量分数、β-桉叶醇质量分数为变量导入SIMCA-P14.1 软件，经HotellingT2检验，30 批样品的T2值均在95%置信区间内，无异常数值，可进一步对其进行主成分分析。主成分分析结果显示，前2 个主成分累积方差贡献率为92.8%，能反映各批次“川朴筒朴”样品92.8%的信息。根据得到的主成分，建立模型，其中能力解释参数R2x（cum）为0.928、Q2（cum）为0.753，模型区分度和预测程度均良好，主成分分析得分图见图2。从图2 可以看出30 批“川朴筒朴”样品可分为3 个等级，一等和三等“川朴筒朴”相距最远，说明两者的性状与内在指标成分含量差异最大。

图2 不同等级“川朴筒朴”样品的主成分分析

2.6.3 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）为了进一步明确不同等级“川朴筒朴”药材的差异特征，在主成分分析的基础上，通过OPLS-DA 可以实现3 个等级“川朴筒朴”样品的有效区分（图3）。本次分析中的自变量拟合指数（R2X）为0.977，因变量拟合指数（R2Y）为0.702，模型预测指数（Q2）为0.629，R2和Q2超过0.5，表示模型拟合结果可接受[16]。经过200 次置换检验结果显示，左侧端随机排列产生的R2、Q2全都小于右侧端的原始值，Q2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于“川朴筒朴”的等级划分。

图3 不同等级“川朴筒朴”样品的OPLS-DA

通过计算变量重要性投影（VIP）值可分析各自变量对因变量的影响作用大小，结果显示，VIP 值为β-桉叶醇质量分数（1.10）>单位质量（1.07）>厚度（1.01）>厚朴酚质量分数（0.99）>和厚朴酚质量分数（0.81）。

2.6.4 “川朴筒朴”质量等级的建立 评价指标的Wi越大，表明该指标越重要，经上述分析发现，化学成分熵权系数与化学成分的VIP 值的大小顺序一致，均为β-桉叶醇质量分数>厚朴酚质量分数>和厚朴酚质量分数。相关性分析结果也表明，由熵权系数计算得到的综合评分与其他各项评价指标均有显著相关性，故化学成分的综合评分能更全面反映药材质量，可作为等级划分的依据。药材在实际采收、加工和运输过程中质量难免损失，导致测量不准确，而厚度则不易发生改变，且经相关性分析发现，单位质量与厚度具有非常显著的正相关关系，为了使等级的划分更简便、准确，故将厚度和化学成分综合评分2 个指标作为“川朴筒朴”等级划分的依据，建立质量等级。一等品的厚度为3 mm及以上，综合评分为0.65 分及以上；二等品的厚度为2～3 mm，综合评分为0.50～0.65 分；三等品的厚度<2 mm，综合评分为0.25～0.50分。

根据建议标准将30 个样品重新划分等级，对于少数不能同时满足以上2 个指标的样品，将数值四舍五入，归入对应的等级。结果显示，重新划分的结果和多元统计分析的结果一致。采用SPSS 26.0软件对建议标准下不同等级“川朴筒朴”样品的厚度、单位质量、厚朴酚质量分数、和厚朴酚质量分数、β-桉叶醇质量分数及综合评分进行单因素方差分析，结果表明，各等级样品以上6个指标的P值均小于0，差异有统计学意义，证实了建议标准具有科学性与合理性。

3 讨论

厚朴中的化学成分以酚类和挥发油类成分为主，其中酚类成分以厚朴酚及和厚朴酚为主，在厚朴中含量占比最高，为厚朴的主要活性物质，对多种癌症也有治疗作用[17]；挥发油类成分中桉叶油醇及其异构体的含量最高，具有抗氧化、抗炎等药理作用[18]。本研究以主要药效成分和厚朴酚、厚朴酚的含量，以及厚朴挥发油中主要成分β-桉叶醇作为厚朴的内在质量指标，将外观性状和内在质量结合，体现了传统“辨状论质”的内涵，更能全面地反映厚朴药材的真实质量。

目前，市场上厚朴药材多以统货流通，导致其质量参差不齐。本研究测定了42 批“川朴筒朴”样品的厚朴酚、和厚朴酚与β-桉叶醇含量，发现其中12 批按原标准划分为三等或四等的样品中厚朴酚及和厚朴酚总量不符合《中国药典》2020 年版规定，且部分四等品的成分含量比三等品更高，其原因除药材内在质量因素外，还有另一个因素就是原标准的局限性，仅凭外观性状划分等级导致其划分的结果具有较大误差。故本研究在测定2 个可量化的外观指标基础上引入信息熵权法，对厚朴中的3 个化学成分含量进行客观赋权，再根据各成分的权重计算综合评分，有效避免了因主观判断误差对权重分配的影响。通过分析内在成分含量及其综合评分与外观性状的相关性，证实了综合评分与其他各项评价指标均具有较强的相关性，较为全面地反映厚朴药材质量，可作为等级划分的依据。本研究根据外观性状与内在品质对符合《中国药典》2020 年版规定的30 批“川朴筒朴”样品经无监督模式的聚类分析和主成分分析，将其分为3 个等级，再经有监督模式的OPLS-DA 对等级模型进行优化，最后对各等级的厚度和化学成分综合评分的范围作出限定，使建立的等级标准更科学、准确。

本研究证实了外观性状指标与内在活性成分厚朴酚、和厚朴酚和β-桉叶醇具有显著的相关性。另外，β-桉叶醇作为厚朴挥发油的主要成分，表征厚朴药材的油润性，与有效成分厚朴酚、和厚朴酚质量分数呈显著正相关，初步阐明了传统性状鉴别中厚朴以“皮厚、质重、气辛”为佳的科学内涵，即深层次的化学成分含量差异表现为性状差异，而性状和成分的差异，预示着药效的差异性。传统“辨状论质”观点认为厚朴以皮厚肉紫、油性大、断面紫棕色有发亮结晶物、气香苦者为佳，故建议在后续研究中将厚朴的颜色、气味、滋味等性状特征采用机器视觉、嗅觉和味觉等技术对“肉紫、气香、味苦”进行数据量化呈现，同时将传统经验鉴别与现代理化鉴别和生物评价相结合，为阐明厚朴“辨状论质”的科学内涵提供更丰富科学的依据。