腐植酸+黄腐酸缓解Cd 对独行菜植株生长、生理和生化特性的不利影响

ErtanYildirim Melek Ekinci MetinTuran GülerayAğar Atilla Dursun，4 Raziye Kul ZeynepAlim Sanem Argin 著 牛华琳 庄 琪 译

1 土耳其阿塔图尔克大学农学院园艺系 埃尔祖鲁姆 25240

2 土耳其耶迪特佩大学遗传学和生物工程专业 伊斯坦布尔 34755

3 土耳其阿塔图尔克大学生物系 埃尔祖鲁姆 25240

4 吉尔吉斯斯坦-土耳其玛纳斯大学园艺和农学系 比什凯克 720001

5 土耳其耶迪特佩大学农业贸易和管理部 伊斯坦布尔 34755

6 山西农业大学园艺学院 晋中 030600

土壤和水是宝贵的自然资源，对农业的可持续发展至关重要。然而，人类活动严重地破坏和污染了土壤和水。其中一个主要问题是污水和工业废物排放到农业地区，造成各种威胁，使环境受到重金属、盐类和硝酸盐的污染（Achakzai 等，2011）。重金属对食物链造成的污染是一个严重的问题，因其高毒性对植物、动物和人类健康构成了威胁（Masindi 等，2018）。

植物有通过其根部吸收各种金属的自然倾向。其中一些是植物的基本微量元素，如Cu2+、Co2+、Fe2+、Mo2+、Mn2+和Zn2+，而Hg2+、Cd2+、Ni2+和Pb2+等则会对植物造成危害。金属对植物的影响因基因型而异（Medyńska-Juraszek 等，2020），其毒性取决于离子类型、离子浓度、植物种类和植物生长阶段（Memon 等，2009；Liu 等，2020）。

在通常被称为“重金属”的污染物中，镉（Cd）是一个主要问题，因为它在植物-土壤系统中具有流动性。尽管Cd 在环境中自然存在的量很小（0.04 ～0.32 mmol），但农业应用的杀虫剂、磷酸盐肥料、非农业产业的落尘和生物固体使土壤中富含这种元素（Monteiro 等，2009）。Cd 的流动性很强，很容易被植物所吸附（Ismael 等，2019）。Cd 特别危险，因为生长在受污染土壤中的植物可能在没有任何明显迹象的情况下大量吸收Cd，并通过喂食进入人体（Dobrikova 等，2021）。因此，植物的低Cd 摄入量以及植物对Cd 污染的生理反应对保护生物多样性和食品安全至关重要。

腐殖物质是重要的有机材料，直接或间接地影响植物生长，改善土壤的物理和化学特性，增加植物产量。一旦这些物质与金属形成化合物，其溶解度和生物利用率就会改变。腐殖物质和有毒的重金属离子之间形成的强键在植物生产中起着重要的作用，可以减轻重金属胁迫对植物发育的负面影响（Ozkay 等，2016）。

与其他蔬菜品种相比，叶菜是高金属离子积累器（Alexander 等，2006）。独行菜（Lepidium sativum）是一种主要生长在温带地区的多叶蔬菜。自古以来，独行菜的种子、叶、根和花都被用来治疗各种疾病或病痛（Mukhopadhyay 等，2010）。早期的报道指出，独行菜对Cd 胁迫敏感。然而，据我们所知，还没有研究调查腐植酸（HA）+黄腐酸（FA）对在Cd 胁迫下独行菜生长的影响。因此，本研究用4 种剂量的HA+FA（0、10、15 和20 mL/L）处理CdSO4•8H2O 污染的土壤（0、100和200 mg Cd/kg），以阐明HA+FA 对缓解Cd 胁迫、促进独行菜植株生长和生理生化特性的影响。

1 材料和方法

1.1 试验设置

独行菜在土耳其阿塔图尔克大学的温室里用聚乙烯盆种植。温室温度白天保持在22（±2）℃，夜间保持在17（±2）℃的平均温度。本研究中使用的土壤是从土耳其埃尔祖鲁姆省（39°55′N，41°61′E）的农田中取样，深度为15 cm。它在室内被烘干，直到可以通过4 mm 的筛子和2 mm的筛子，分别用于盆栽实验和物理化学性质的分析。根据土壤分类学，该土壤被归类为Ustorthents（土壤调查人员，1999）。土壤的成分是33%的沙、34%的淤泥、33%的粘土、1.2%的有机物。其他物理和化学性质为pH 值：5.61；阳离子交换容量：15.5 cmol（+）/kg；电导率：1.15 dS/m；总氮：1.15%；P：15.5 mg/kg；Zn：2.30 mg/kg；Cu：1.1 mg/kg；Fe：0.5 mg/kg；Mn：1.8 mg/kg；Cd：0.05 mg/kg；K：2.2 cmol(+)/kg；Ca：11.0 cmol(+)/kg；Mg：2.25 cmol(+)/kg。

对于重金属胁迫处理，将镉（CdSO4•8H2O）以3 种不同的浓度（0、100 和200 mg/kg）混入培养基，并培养3 周。

HA+FA 是由德国Humintech GmbH 提供的商品，即Powhumus。Powhumus的含量（干重%）如下。HA+FA：80% ～85%（HA90%，FA10%）， 钾（K2O）：10% ～12%； 总有机氮：1.0%。 不溶性成分的颗粒大小为<100 μm，pH 值为9 ～10。Powhumus 的元素含量（%，质量）为C-32，H-2.8，N-1.3，灰分含量为22.9%。在无灰的基础上的元素含量（% wt）为C-47.1；H-3.63；N-1.69；O-47.58。为了制备HA+FA（Powhumus）溶液，将350 g Powhumus 溶解在1 L 水中（350000 mg/L），然后稀释以获得3 种不同的浓度（3500、5250 和7000 mg/L）。HA+FA 溶液从种植的前一天开始每周3 次施于土壤中。使用0 mg/L HA+FA 作为对照，而150 ∶100 ∶150 kg/hm2的氮磷钾被混合到培养基中作为基肥。

独行菜的种子被播种在装满1 L 3 周培养的园土∶沙子（1 ∶1，v ∶v）混合物的花盆中，深度为1 ～1.5 cm，每盆有10 颗种子。出苗后，每盆留外观相同的4 株小苗。

1.2 测定指标与方法

盆栽研究在种子播种后的第50 天结束。收获时，从每个样品中抽取4 株，测量茎粗、株高、叶片数、地上部和根部干鲜重。为了测定干重，植物材料在70 ℃下保存48 h。为了测定脯氨酸、蔗糖、丙二醛（MDA）、H2O2，以及抗氧化酶的活性，将大约20 g 的新鲜叶片在液氮中冷冻，然后在-80 ℃下储存。分析是在一式四份的情况下进行的。

叶绿素读取值（CRV 为SPAD 值）：植物叶片的叶绿素含量由叶绿素仪（SPAD-502，Konica Minolta Sensing, Inc，日本）测定。

叶面积：使用叶面积测量仪（CID-202 便携式激光叶面积测量仪，CID 生物科学公司，美国华盛顿州）确定每次应用中植物的叶面积。

膜渗透性（MP）：MP 是根据Yildirim 等的方法测定的（Yildirim 等，2015）。

叶片相对含水量（LRWC）：LRWC 是根据Yildirim 等的方法测定的（Yildirim 等，2015）。

H2O2和MDA 分析：H2O2是根据Velikova 等（Velikova 等，2000）的方法测定的。H2O2的含量是通过使用先前由不同浓度的H2O2的标准校准曲线来计算的。MDA 含量是以硫代巴比妥酸反应性物质测量的，MDA 是脂质的降解产物，它可以确定脂质过氧化情况。通过使用155 mmol/L cm 的消光系数，从吸光度曲线上确定MDA 的浓度。

蔗糖和脯氨酸分析：蔗糖浓度由Chopra 等（Chopra 等，2000）给出的方法测量。脯氨酸的浓度是在520 nm处进行分光光度测定的（Dadasoglu等，2021）。

过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性：CAT、POD 和SOD 的活性是根据Sahin 等（Sahin 等，2018）给出的方法测定的。

矿物质分析：独行菜的叶子在68 ℃的烘箱中干燥48 h 后被研磨。使用Vapodest 10 快速凯氏蒸馏装置（Gerhardt，Konigswinter，德国），通过凯氏方法测定总氮。使用电感耦合等离子体分光光度计（Optima 2100 DV, ICP/ OES; Perkin-Elmer,Shelton, CT）来测定组织的P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Cl 和Cd（Mertens 等，2005；Mertens 等，2005）。

1.3 数据分析

在实验中，采用了随机小区设计，并使用SPSS 20 统计包程序对获得的数据进行了分析。对数据进行了方差分析（ANOVA），并通过Duncan多重比较试验确定了平均值的差异。

2 结果

从表1 可以看出，在Cd 胁迫条件下，施用HA+FA 对独行菜的叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重有明显影响。我们的研究结果表明，Cd 污染对所有被调查的参数都有负面影响，而且负面影响随着污染剂量的增加而增加。在没有Cd 污染的情况下，当HA+FA 的应用浓度为7000 mg/L 时，植物的叶鲜重和叶干重最高；而当HA+FA 的应用浓度为3500 mg/L 时，根鲜重和根干重最高。这些发现表明，在没有Cd 污染的情况下，与对照组（HA+FA=0 mg/L）相比，应用7000 mg/L HA+FA时，叶片鲜重和干重分别增加了35%和30%，而应用3500 mg/L HA+FA 时，根部鲜重和干重增加了33%和15%。

表1 Cd 和HA 的施用对独行菜的叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重的影响Tab.1 Eff ects of cadmium and HA applications on leaf fresh, leaf dry, root fresh and root dry weight of garden cress

在Cd 污染下，叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重都受到了负面影响。然而，HA+FA 的应用减轻了Cd 对植物的有害影响。在200 mg/kg 的Cd 污染下，与对照组相比，浓度为7000 mg/L 的HA+FA 应用使叶鲜重、叶干重、根鲜重和根干重分别增加了262%、137%、550%和133%（表1）。

表2 显示了HA+FA 的应用对Cd 胁迫下的独行菜的茎粗、叶面积和CRV 的影响。Cd 污染显著降低了独行菜的茎粗、叶面积和CRV。最负面的影响发生在200 mg/kg 的Cd 污染。然而，HA+FA的应用减少了100 和200 mg/kg 的Cd 胁迫对独行菜的负面影响。在200 mg/kg 的Cd 污染下，与对照组相比，施用浓度为7000 mg/L 的HA+FA，茎粗、叶面积和CRV 分别增加了92%、104%和34%。

表2 Cd 和HA 的施用对独行菜茎粗、叶面积、CRV、MP 和LRWC 的影响Tab.2 Eff ects of cadmium and HA applications on stem diameter, leaf area, CRV, MP and LRWC of garden cress

此外，Cd 污染增加了独行菜的MP 值，同时降低了LRWC值。植物在仅200 mg/kg的Cd处理下，其MP 值最高，LRWC 值最低。而HA+FA 的应用缓解了Cd 对独行菜的不利影响，在200 mg/kg Cd污染下，7000 mg/L 的HA+FA 处理，与对照组相比，MP 和LRWC 值分别增加了537%和32%。

由表3 可知，CAT、POD 和SOD 活性随着Cd 污染的增加而增加。在200 mg/kg Cd 污染下，7000 mg/L HA+FA 的处理，与未施用HA+FA 的处理相比，CAT 和SOD 活性分别下降了43%和21%，而POD 活性则提高了186%。尽管独行菜在200 mg/kg 的Cd 污染处理下获得了最高的H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖值，但浓度为7000 mg/L 的HA+FA 处理成功缓解了200 mg/kg Cd 胁迫带来的有害影响，使H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖值分别下降66%、68%、70%和56%（表3）。

表3 镉和HA 的施用对独行菜CAT、POD、SOD、H2O2、MDA、脯氨酸和蔗糖的影响Tab.3 Eff ects of cadmium and HA applications on CAT, POD, SOD, H2O2, MDA, proline and sucrose activities of garden cress

由表4、表5 可知，除了Cd 元素外，Cd 污染减少了独行菜其他矿物元素含量。而在施用HA+FA 后，除了Cd 元素外，其他矿物元素的含量都得到了提高。N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、B 和Cl 都在没有Cd 污染与7000 mg/L HA+FA 的处理下得到了最高值，在200 mg/kg 的Cd 与0 mg/L HA+FA 的处理下得到了最低值。7000 mg/L HA+FA 的处理成功缓解了Cd 胁迫带来的有害影响，与对照组相比，N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn 和B 分别增加了75%、23%、84%、87%、40%、85%、143%、1%、65%和115%。另一方面，7000 mg/L HA+FA 的处理成功减少了独行菜对Cd 和Cl 的吸收，与对照组相比，分别减少了95%和80%。

表4 Cd 和HA 的施用对独行菜宏观元素含量的影响Tab.4 Eff ects of cadmium and HA applications on macro element content of garden cress

表5 Cd 和HA 的施用对独行菜微量元素含量的影响Tab.5 Eff ects of cadmium and HA applications on micro element content of garden cress

3 讨论

重金属会对植物造成有毒影响，如缺绿病，抑制生长和光合作用、水分平衡的变化和营养物质的摄入，最终导致植物死亡（Singh 等，2016）。重金属的毒性通过4 个可能的机制在植物中表现出毒性，它们是（i）在根表面与营养阳离子竞争吸附（例如，As 和Cd 分别与P 和Zn 竞争吸附）；（ii）直接相互作用使巯基（-SH）失活，破坏了植物的结构和功能；（iii）通过取代特定结合位点的必需阳离子来破坏酶的功能；以及（iv）产生活性氧（ROS），最终损害大分子（Sharma 等，2009）。

Cd 被认为是一种重要的污染物，因为它具有高毒性和高水溶性。Cd 可以通过其对土壤中矿物质的影响或通过减少土壤微生物的数量来改变矿物的吸收。Cd 可能对气孔导电性、排汗和光合作用产生负面影响。萎黄、叶褶皱和矮小是植物Cd 中毒的常见和易见的症状。Cd 还通过抑制硝酸还原酶活性来减少硝酸盐的摄取以及其从根部到枝条的运输（Prerna 等，2019）。

在本研究中，发现Cd 胁迫对独行菜的生长有负面影响（表1）。Cd 胁迫下生长的独行菜虽然其LRWC 减少，但是MP 增加（表2）。同样，以往的研究表明Cd 胁迫对萝卜（Farouk 等，2011）、 独行菜（Pavel 等，2013；Pirdosti 等，2018）和莴苣（Loi 等，2017）的植株生长特性有负面影响。

另一方面，在Cd 胁迫下生长的独行菜中施用HA+FA 对其生长有积极影响（表1）。此外，HA+FA 的施用增加了独行菜的LRWC，减少了MP（表2）。同样，在以前的研究中，HA+FA的应用减轻了重金属胁迫对莴苣（Haghighi 等，2010）、萝卜（Farouk 等，2011）、卷曲莴苣（Ozkay等，2016）、三叶草（Sergiev 等，2012）、玉米（Chaab 等，2015）和小麦（Rashid 等，2018）植株生长特性的负面影响。腐殖物质是存在于腐殖质中的天然有机聚电解质，它可以稳定土壤中的有机质。许多研究者曾经报道，腐殖物质能够促进植物在不同胁迫条件下的生长（Sergiev 等，2012）。HA+FA 通过改善土壤的一些物理和化学特性，直接或间接地影响植物生长和产量。此外，HA+FA改变了有毒重金属的溶解度和生物利用率，通过强键与它们形成化合物，从而减少重金属对植物生长的胁迫（Ozkay 等，2016）。与重金属形成的这些强键是HA 和FA 的阳离子交换能力（CEC）的结果。由于其结构中含有大量的羧基和酚羟基，腐殖物质具有很高的阳离子交换能力，HA 和FA的阳离子交换能力分别为600 ～890 cmol(+)/kg 和1000 ～1230 cmol(+)/kg（Conte 等，2005；Tan 等，2014）。这些能力是普通粘土矿物的5 至100 倍，这使得腐殖物质成为完美的稳定剂。此外，尽管有各种方法和技术被用于稳定Cd、Pb、Cu 和Zn，但是应用腐殖物质是唯一的非化学和自然方法。

本研究中，在没有Cd 胁迫的情况下，应用HA+FA 没有观察到CAT 活性的变化。另一方面，Cd 胁迫对CAT 活性的影响随对照组（HA+FA=0）所应用的Cd 浓度而变化，即当Cd 污染水平为100 mg/kg 时，CAT 活性下降，但当Cd 浓度变为200 mg/kg 时，CAT 活性上升。尽管CAT 活性在200 mg/kgCd 污染的对照组中达到了非常高的水平（约90 EU/gr leaf），但施用浓度为7000 mg/L 的HA+FA 后，CAT 活性明显下降，甚至下降到低于没有Cd 胁迫时的水平（约75 EU/gr leaf）（表3）。

本研究结果也表明，Cd 胁迫条件下增加了独行菜的POD 和SOD 活性，而在HA+FA 处理下，POD 活性得到大幅度增加，SOD 活性下降（表3）。

不同的研究表明，各种环境胁迫（盐度、缺水和重金属）会影响酶的活性（Shams 等，2020）。Shao 等（Shao 等，2008）表明，在胁迫条件下，抗氧化活性增强。另一方面，Sergiev 等（Sergiev 等，2012）认为，重金属的应用对CAT 的活性没有显著影响，而对三叶草的SOD、GST（谷胱甘肽-S-转移酶）和GPOX（愈创木酚过氧化物酶）活性却有增加。这与我们的结果相似，Ozkay 等（Ozkay 等，2016）指出，重金属胁迫增加了卷曲生菜的SOD活性，而HA 的应用支持了这种增加。有研究报告说，HA 作为活性氧的清除剂，它的应用导致了SOD 和GST 活性的进一步增加。HA 的这种积极作用很可能是由于其在营养介质或植物中形成了螯合络合物。研究表明，HA 和FA 能有效地固定重金属，并在矿物土壤中发挥更大的作用（Tang 等，2014）。且其固定能力与腐殖物质中添加的FA 含量直接相关。因为FA 的尺寸（分子量）较小，氧含量较高，是HA 的两倍，所以其流动性较高。此外，由于在其结构中存在许多羧基（COOH）和羟基（COH）[范围从520 到1120 cmol (H+)/kg]，FA的反应性更高，这使得FA 的交换能力是HA 的两倍以上。

土壤中金属的性能受到HA 和FA 施用的影响。HA 和FA 对土壤中Pb、Cd、Ni 的影响以及对植物的可利用性已经得到了广泛的研究。但是，由于HA 和FA 的复杂性和土壤特性的巨大差异，目前已经报道出一些不一致的结果（Janos 等，2010；Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。

早期的报道表明，HA 和FA 处理是通过影响土壤中可交换性的养分形态（Janos 等，2010），并减少Pb 和Cd 的积累来影响植物的（Kalis 等，2006）。在酸性土壤中，腐殖物质对重金属有抑制作用（Borůvka 等，2004；Rong 等，2020；Jiang等，2005；Wang 等，2017；Wu 等，2017）。 相反，在碱性土壤中发现腐殖物质会刺激金属的可用性（Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。这种矛盾可用腐植酸含量中未被注意到的FA 的作用来解释。腐殖物质在低pH 值下对金属有效性的抑制作用的根本原因是，金属和FA 之间形成的键在酸性条件下占优势。事实上，在腐殖物质中FA 含量为5%或更多的情况下，重金属的结合和固定能力在中性和偏酸性土壤中特别高。相反，与FA 含量相比，HA 含量很高的腐殖物质会增加重金属的可用性。可以说，HA 对重金属的生物修复是有效的，因为HA 可以与金属相互作用，形成金属-腐植酸复合物（Tang 等，2014）。另一方面，FA 有抑制金属可用性的报道，可用于减少金属在污染的酸性土壤中的积累。HA 对土壤中重金属的存在有刺激作用并对碱性土壤中的金属生物修复有很好的效果（Topcuoglu 等，2012；Park 等，2012）。

综上，Cd 污染对植株鲜重和干重等生长参数有负面影响。然而研究发现，HA+FA 的施用可以减少这种负面影响，且HA+FA 的浓度为7000 mg/L 时效果最佳。本文结果表明，施用高比例的FA，即本研究中的10%，是缓解重金属胁迫对植株生长不利影响的关键。

译自：Scientif ic Reports，2021，11（1）：1 ～8。