长链非编码RNA SOX9-AS1在原发性肝细胞癌中的诊断价值

黄颖, 黄楠, 宋菊, 季沈杰, 王钦君

启东市人民医院 启东肝癌防治研究所 南通大学附属启东医院检验科,江苏启东 226200

原发性肝癌是来源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,以原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见,死亡率位居第三位[1],5年生存率仅为10%[2],因此HCC的早期诊断尤为重要。目前临床上常用筛查指标是甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP),其灵敏度和特异度均不高,在某些良性肝脏疾病如肝硬化(liver cirrhosis,LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)中亦可出现AFP不同程度升高[3-4]。因此,需要寻找灵敏度、特异度更高的新肝癌标志物。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与多种肿瘤的发生和发展[5-7],可通过调控多个通路的关键基因表达影响肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,从而促进肝癌发展和转移[8]。有研究发现,SOX9-AS1在肝癌组织中高表达,且与HCC患者预后不良密切相关[9],但目前尚未有研究探索血清SOX9-AS1在肝癌患者中的诊断价值,本研究对此进行了探讨,评价其作为肝癌诊断标志物的临床价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集本院2019年12月—2022年1月就诊肝病患者180例,其中HCC组70例,男性49例,女性21例;LC组55例,男性24例,女性31例;CHB组55例,男性31例,女性24例。HCC、LC患者经实验室、影像学及病理学检查明确诊断,CHB患者纳入标准为HBsAg阳性>6个月且排除肝癌、肝硬化、其他器官肿瘤等重大疾病。健康对照组(healthy controls,HC)为同期体检健康者50例,男性35例,女性15例。所有受试者均签署知情同意书,本研究经本院医学伦理学委员会批准(ER-XJS-LWTG-2020018)。收集各组一般资料和实验室常规检测项目,包括总胆红素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)和AFP。

1.2 qRT-PCR检测血清SOX9-AS1

利用血清总RNA提取试剂盒(北京BioTeke公司)提取血清总RNA。按反转录试剂盒(美国Theromo)说明书配置反应体系,选择CFX96 Deep Well基因扩增仪做反转录(美国Bio-Rad),反应条件:42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。cDNA产物于-80 ℃冰箱保存备用。引物序列SOX9-AS1正向:5′-ACGTCAGCGAGCTTGAGAAA-3′,反向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′;内参GAPDH正向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′,反向:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′(上海生工)。PCR反应体系:SYBR GreenⅠmix 10 μL、cDNA 3 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、RNase-free water 5 μL,共20 μL。PCR反应条件:95 ℃ 10 min,1个循环;95 ℃ 15 s、、56 ℃30 s、72 ℃30 s,共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算靶基因SOX9-AS1相对表达水平,计算公式ΔΔCt=实验组(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)-对照组(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)。

1.3 方法学评价

由于目前市场上没有SOX9-AS1标准品售卖,因此以50名健康体检者混合血清为标准品进行检测。将混合血清以1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀释,绘制标准曲线,根据E=10-1/slope-1计算扩增效率,评价检测方法的线性。将混合血清同一批次进行10次平行孔检测SOX9-AS1水平,计算批内变异系数;将混合血清分成10等份,每天提取1份检测,计算批间变异系数,以此评价检测方法的精密度。将混合血清在室温下放置0、6、12、18、24 h以及反复冻融0、2、4、6、8次后提取并检测,以此评价血清SOX9-AS1稳定性。采用建立的qRT-PCR法双复孔检测所有血清样本。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7软件进行数据分析。计数资料以例(%)表示,计量资料以中位数(四分位数)表示,采用Kruskal-Wallis检验。采用ROC评价SOX9-AS1、AFP对HCC的诊断效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组一般资料和实验室指标的比较

HCC组、LC组、CHB组和HC组之间比较,年龄、TBIL、ALB、GPT、GOT的差异均有统计学意义(P<0.05;表1)。HCC组、LC组、CHB组及HC组血清AFP水平依次降低,HCC组AFP水平最高(P<0.05;表1)。

表1 各组一般资料和实验室指标的比较

2.2 SOX9-AS1线性、精密度和稳定性

SOX9-AS1标准曲线为Y=-3.441X+26.27,R2=0.9978,扩增效率为0.952 5(图1)。SOX9-AS1批内变异系数为2.82%,SOX9-AS1批间变异系数为1.19%。混合血清在室温下放置0、6、12、18、24 h以及反复冻融0、2、4、6、8次后检测SOX9-AS1表达水平均无明显差异(P>0.05,图1),提示SOX9-AS1稳定性良好。

2.3 各组血清SOX9-AS1的比较

HCC组、LC组、CHB组及HC组血清SOX9-AS1依次降低,HCC组SOX9-AS1水平最高(P<0.05;图2)。

图2 各组血清SOX9-AS1的比较

2.4 血清SOX9-AS1、AFP对HCC的诊断效能

SOX9-AS1联合AFP对HCC的诊断效能最高(P<0.05;表2和图3)。

图3 血清SOX9-AS1、AFP单独或联合诊断的ROC曲线

表2 血清SOX9-AS1、AFP对HCC的诊断效能

3 讨 论

研究证明,lncRNA可作为肿瘤辅助诊断和预后判断的标志物[5-9]。Han等[10]发现,SCARNA10在HCC患者血清中的表达水平明显高于LC和CHB患者,其诊断效能优于传统的AFP。LncRNA CRNDE在HCC患者血清中高表达,其表达水平与肿瘤大小、分化程度和TNM分期有关,lncRNA CRNDE高表达患者的总体生存率和无病生存率明显低于低表达患者,Cox回归分析提示lncRNA CRNDE可作为HCC的独立预后因素[11]。除此之外,HULC、MALAT1、UCA1等循环肿瘤lncRNA也被证实对HCC的辅助诊断有一定的价值[12-14]。

SOX9-AS1是lncRNA SOX9的反义链,在HCC肿瘤组织和细胞中高表达,与miR-5590-3p和SOX9形成SOX9-AS1/miR-5590-3p/SOX9正反馈回路,调控Wnt/β-catenin通路,促进HCC生长和转移[9]。为了探讨SOX9-AS1对HCC的诊断价值,本研究采用qRT-PCR检测血清SOX9-AS1,绘制SOX9-AS1标准曲线,线性回归系数R2为0.997 8,说明方法线性良好;计算SOX9-AS1扩增效率为0.952 5,符合qPCR进行定量分析的扩增效率范围要求;批内变异系数为2.82%,批间变异系数为1.19%,符合临床检验定量检测项目精密度要求;混合血清在室温放置一定时间或反复冻融后检测结果无明显变化,说明血清稳定性良好。

本研究发现,HCC组、LC组、CHB组及HC组血清SOX9-AS1依次降低,提示SOX9-AS1不仅能区分HCC患者与健康对照者,还能有效区分LC患者与CHB患者。目前临床上用来诊断HCC的血清学标志物AFP特异性不高,在本研究中纳入的55例LC患者和55例CHB患者血清中也能观察到AFP不同程度升高。ROC曲线分析显示,SOX9-AS1对HCC具有一定的诊断价值,将SOX9-AS1与AFP联合检测,诊断效能优于两者单项检测。

综上所述,SOX9-AS1升高可用于区分肝癌患者与健康对照者,可用于监测肝脏疾病的进展。SOX9-AS1与AFP联合检测能有效提高诊断效能,血清SOX9-AS1有望成为新的肝癌诊断标志物。但本研究缺乏随访数据,无法进行生存分析,SOX9-AS1与肝癌预后的关系仍需进一步探索。