鱼类干扰素调控因子（IRF）的抗病毒作用研究现状及进展

姜晓娜，贾智英

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

在鱼类中，病毒感染会引起许多宿主基因的表达，进而使机体对病毒产生抗性免疫反应，干扰素（interferon regulatory factor,IFN）是鱼体受到病毒感染或细菌等因素下在受体细胞迅速反应并产生的一种具有高生物活性的糖蛋白[1]。IFN 与其同源受体（interferon regulatory factor receptor,IFNR）结合激活Jak-STAT 信号通路，Jak-STAT 信号转导促进干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISG）与多种ISG 的IFN 激活调控元件（interferon stimulation reaction element,ISRE）结合，进而诱导多种抗病毒基因的表达[2]，抑制病毒mRNA 翻译，增加宿主细胞的抵抗力，在机体抗病毒免疫应答中起重要作用[3]。干扰素调控因子（interferon regulatory factor,IRF）作为参与IFN 抗病毒免疫反应中的重要转录调节因子，启动IFN 的转录表达[4]。

1 IRF 家族

1988 年，IRF1（Homo sapiens）作为IRF 家族的第一个成员被发现，确定其具有启动IFN 转录表达的作用[5]。迄今为止，脊椎动物鉴定出11 个IRF 家族成员，包括IRF1-11[6]，其中IRF10 为鱼类和鸟类中特有，而IRF11 为硬骨鱼特有[7,8]。根据C 端结构特征和系统发育分析，IRF 家族可分为四个亚家族：IRF1 亚家族（包含IRF1、IRF2 和IRF11）、IRF3 亚家族（IRF3 和IRF7）、IRF4 亚家族（IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10）和IRF5 亚家族（IRF5 和IRF6），表明了IRF 家族基因在进化过程中的功能多样性。IRF 家族成员是鱼类先天抗病毒反应的主要调节因子，主要参与IFN 和ISG 的转录表达[9]。IRF 家族蛋白结构均含有一个高度保守的N 端DNA 结构域（DNA binding domain,DBD）和一个C 端IRF 相关结构域（IRF-associated domain,IAD）。DBD 具有5或6 个色氨酸重复元件的特征，可形成螺旋-转角-螺旋结构，使IRF 蛋白能够识别并结合在ISRE基因的启动子中[10]。IAD 目前确定具有IAD1 和IAD2 两种类型，其中IAD1 存在于所有IRF 中，IAD2 存在仅存在于IRF1 和IRF2 中[11]。IAD 保守性较低，能够与其他IRF 成员相互作用形成转录复合物，激活每个IRF 成员特定的生物活性，调控不同IFN 或ISG 的转录表达[10]。

2 IRF 的抗病毒作用

2.1 IRF1 亚家族

IRF1 亚家族包括IRF1、IRF2、IRF11，其 中IRF1 为IRF 家族中最初定义为调控IFN 转录表达的调控因子[5]。IRF1、IRF2 和IRF11 在鱼类组织呈现组成型表达[12-15]。研究发现哺乳动物和硬骨鱼类的主要先天免疫信号通路是相对保守的，在斑马鱼中发现参与先天免疫反应的IRF1、IRF2 和IRF11基因，其中IRF11 与IRF1 和IRF2 的遗传距离相等[5]。硬骨鱼类中IRF1、IRF2 和IRF11 均含有5 或6 个高度保守的色氨酸残基（NH2-X10-W-X14-WX11-W-X7-W-X11-W-18-W）[14]。此外，发现鱼类中IRF1 基因和IRF11 基因均与IFN 基因启动子的同一段DNA 序列结合，但结合偏好性有所不同[8,16]。IRF2 蛋白结构中IAD2 中的含有一个IRF1 蛋白不具有的反式激活域，以上均导致了IRF1、IRF2 和IRF11 的功能多样性。

鱼类中IRF1、IRF2 和IRF11 的表达调控及抗病毒作用机制存在差异。鱼类中IRF1 是抗病毒反应调控IFN 转录表达的正调节因子[16]，受到病毒、poly（I:C）刺激后能诱导IFN 及ISG 的转录表达[6,14,16,17]，在虹鳟（Salmo playtcephalus）中还确定了IRF1a 的存在[18]。但鱼类IRF2 对病毒的抗性调节有所不同，鲤（Cyprinus carpio）受嗜水气单胞菌和poly（I:C）刺激后IRF2 基因能够抑制IFN 基因和ISG 基因的表达，但能够激活NF-κB 信号通路并促进MyD88 介导和β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIRdomain-containing adoptor inducing interfere-β，TRIF）介导的NF-κB 产生[12]。草鱼（Ctenopharyngodon idella）中IRF2 能够与IFN 的启动子结合下调IFN的转录活性[19]。然而IRF2 在卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）中正调控IFNa3 和IFNγ 的转录表达[20]。在大黄鱼（Larimichthys crocea）中IRF2 能够既诱导IFNd 和IFNh 启动子活性，又抑制IFNc 启动子活性，能够抑制上皮细胞中鲤春病毒血症病毒（infection with Spring Viraemia of Carp Virus,SVCV）的复制[21]。鱼类IRF11 是I 型IFN 的正调节因子，能够在培养鱼细胞中建立抗病毒状态以抵抗病毒感染[8]，曾因与IRF1 高度同源被错误地认为是IRF1[22]，斑马鱼（Danio rerio）和翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）中发现IRF11 能通过正调控IFN 或ISGs 基因的转录表达发挥抗病毒作用[8,22]。此外，鱼类中IRF1 和IRF2 和IRF11 除单独发挥抗病毒作用外，也互相协同或拮抗来调控IFN 或ISG 的转录表达进而使机体产生抗病毒免疫反应。大西洋鲑（Salmo salar）和草鱼中均确定IRF2 能通过与IRF1 拮抗作用来作为IFN 和ISG 的负调控因子[19]。斑马鱼中IRF1 基因在病毒感染和poly（I:C）刺激后的表达倍增水平高于IRF11 基因，IFNγ 能够诱导IRF1 基因的表达而与IRF11 基因的表达及启动子活性无关[8,16]。

2.2 IRF3 亚家族

IRF3 亚家族包括IRF3 和IRF7，IRF3 和IRF7被作为是病毒感染细胞的主要调节因子，参与机体抗病毒防御反应[23]，因此在鱼类中IRF3 和IRF7 的相关机制研究较为广泛。目前IRF3 和IRF7 基因已在多种鱼类中得到验证，且均在组织呈现组成型表达[24,25]。IRF3 和IRF7 均包含三个结构域，分别为N端DBD、C 端IAD 和富含丝氨酸的结构域（serine-rich domain,SRD），IAD 参与除IRF1 和IRF2 外的其他IRF 的交互作用，DBD 是负责与IRF 元件结合的核心部位，IRF3 和IRF7 的结构域通过与基因调控区内的DNA 序列相互作用以调控自身转录[26]。此外，研究发现虹鳟IRF3 的DBD 区域包含五种色氨酸，但IRF7 仅含有4 种，且IRF3 主要存在于细胞质中并被病毒、ploy（I：C）和脂多糖（Liposome,LPS）激活，而IRF7 仅能被病毒激活[27-29]。在机体受病毒感染后，模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）启动信号转导并激活Tank 结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）来磷酸化IRF3 和IRF7 蛋白C 端富含丝氨酸区域的丝氨酸或苏氨酸残基，随后磷酸化的IRF3 进入细胞核并介导IFN-α 和IFN-β以及其他IFN 诱导基因的转录[30,31]。

鱼类和哺乳动物共享相同或相似的IFN 激活信号通路，IRF3 和IRF7 是机体应对可变致病性感染的信号级联的核心参与者，对IFN 转录表达调节起关键作用[32]。大西洋鲑中髓样分化因子（myeloiddifferentiationfactor88,MyD88）与IRF3 相互作用正向调节IFN 转录表达[33]。大黄鱼中IRF3 能够减弱核因子kappaB 抑制蛋白（nuclear factor kappa-B,IκBα 对核因子（nuclear factor kappa-B,NF-κB）活化的抑制作用[34]。病原体诱导宿主IRF3 表达正向调节MyD88 介导硬骨鱼NF-κB 信号通路转导[35]。然而赵雪妍等发现IRF3 在硬骨鱼中负调控TRIF 介导的NF-κB 信号通路[36]。鲫（Carassius auratus）和斑马鱼受病毒感染后IRF7 基因参与IFN基因转录表达及磷酸化反应过程，是机体抗病毒反应的主要调控因子[37,38]。当细胞受到病毒感染后，IRF7 基因启动IFNI 基因的转录并诱导ISG 基因表达以保护细胞免受病毒感染[28]。研究发现青鱼（Mylopharyngodon piceus）受到草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）和SVCV 感染后IRF3/7 基因在机体抗病毒免疫反应中发挥至关重要的作用[39]。IRF3/7 基因在尖吻鲈（Lates calcarifer）和虹鳟中均发现能够诱导IFN、ISGs 基因和促炎因子的表达，在IFN 介导的抗病毒免疫反应中的发挥重要作用[ 40 ]。

2.3 IRF4 亚家族

IRF4 亚家族包括IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10。目前IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 基因已在多种硬骨鱼中被克隆完成[41]。硬骨鱼中IRF4、IRF8、IRF9 和IRF10 在组织中呈现组成型表达，且主要在富含淋巴细胞的组织中高表达[41,42]，IRF4 和IRF8、IRF9 和IRF10 蛋白均含有DBD 和IAD，不同的是除IRF10外，均含有一或两个核定位信号（nuclea rlocalization signal,NLS），这些信号与IRF 在末端区域的核易位和保留有关[43]。IRF4 和IRF8 和IRF10 的DBD 区域均含有5 个色氨酸残基，但IRF9 只有三个。IRF4 对靶基因转录调控和识别是通过形成与其他蛋白质或转录因子相互作用的二聚体来定义的[44]，IRF4 在进化上存在明显的差异，该蛋白中富含丝氨酸的结构域目前仅在斑马鱼、河豚（Tetraodontidae）、青鳉（Oryzias latipes）、斑石鲷（Oplegnathuspunctatus）和斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）中存在，而在非洲爪蟾（Xenopus laevis）、虹鳟和亚洲沼泽鳗（Monopterus albus）中不存在。IRF8 通常与识别靶基因启动子中的Ets-IRF-E 复合元件（ETS-IRF-E composite element,EICE）的Ets 家族成员PU.1/Spi-1相互作用以发挥其转录调节作用[45]。IRF9 能够与信号转导与转录激活因子1 和2（signal transducer and activator of transcription,STAT1-STAT2）异二聚体的结合后加强对ISRE 的特异性识别[46]，IRF10 蛋白结构在硬骨鱼中相对保守，其中DBD 结构是IRF10发挥功能是不可或缺的[47]。

IRF4 和IRF8 在硬骨鱼中能够被poly（I:C）、LPS 和各种细菌和病毒诱导，参与机体抗病毒免疫反应，最近研究发现IRF4 在斑马鱼、河豚和青鳉中存在两个IRF4 旁系物（IRF4a 和IRF4b），受到GCRV 和SVCV 刺激后表达水平显著提高[41]。卵形鲳鲹IRF8 基因能够在体外上调IFNr 基因的表达[48]。草鱼IRF8 基因下调IFN1 基因的表达[49]，（Miichthys miiuy）IRF8 基因下调MyD88 和MyD88介导的NF-κB 信号通路的表达，以防止体外过度免疫损伤[33]。在病毒微生物入侵鲫时，宿主中IFNs诱导STAT1 与IRF9 形成ISGF3 复合物，激活ISGs的转录以抵抗病毒入侵[50]。硬骨鱼中IRF10 基因被病毒、poly（I：C）、细菌、LPS 等刺激下上调表达[85,105-108]。牙鲆（Paralichthys olivaceus）感染细菌或病毒出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）后IRF10 基因在肾脏组织中表达量升高，但斑马鱼和斜带石斑鱼中发现IRF10 为干扰素转录表达的负调节剂[51]。在大西洋鳕（Gadus morhua（Linnaeus,1758））和斜带石斑鱼中发现IRF10 基因具有两个剪切体，在鱼类抗病毒免疫反应中发挥功能有所不同[47]。IRF4 基因能够在斜带石斑鱼的抗病毒反应中抑制抗粘性病毒基因（myxovims resistant 1,Mx1）的启动子活性，促进病毒复制[51]。然而在鲤上皮瘤细胞（Epitheliomacells,EPC）细胞缺失IRF9 会抑制Mx1 和ISG15 的表达[52]。欧洲沼泽鳗被poly（I:C）、LPS 刺激后能够诱导IRF4 和IRF10 基因的表达[41]。

2.4 IRF5 亚家族

IRF5 亚家族包含IRF5 和IRF6，目前IRF5 基因已在多种硬骨鱼中报道[53-55]，而IRF6 基因目前在鱼类中仅在斑马鱼、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、膨腹海马（Hippocampus abdominalis）和团头鲂（Megalobrama amblycephala）中被发现[56]。IRF5 和IRF6 基因在硬骨鱼组织中均呈现组成型表达，但表达水平因组织而异，IRF5 基因在鳃、头肾和脾脏等免疫组织中有更高水平的表达[54]。IRF5 蛋白结构包括DBD、中间域（middle region,MR）、IAD、病毒激活域（viral activation domain,VAD），N 末端和C 末端含有在病毒感染细胞中发挥了至关重要的作用[43,54]，IRF6 蛋白的C 端IAD 参与抗病毒免疫反应[57]。

IRF5 可以在硬骨鱼受到病毒、细菌感染后产生的抗病毒和抗菌反应中发挥作用[53-55]。IRF5 基因在草鱼中参与LPS 诱导的IFN 信号通路，参与宿主先天免疫反应[58]。IRF5 基因能够在卵形鲳鲹中正向调控IFNI、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6）、Mx1、ISG15、毒蛇毒素（Viperin1）和Viperin2 抗病毒因子的表达[59]。鱼类IRF6 是干扰素转录的正调节因子，并能够被MyD88 和TBK1 磷酸化，进而参与抗病毒免疫反应[60]。斑马鱼中IRF6 能够减少细胞中SVCV 病毒的复制，在膨腹海马中IRF6 基因直接参与了宿主抗病毒防御机制，半滑舌鳎和团头鲂中IRF6 基因在细菌感染后肝脏、脾脏和头肾组织中均显著上调[16,56,60]。目前IRF5 基因在硬骨鱼抗病毒免疫反应中的作用已被证实，但IRF6 基因在大多数鱼类中的功能尚不清晰。

3 讨论

目前研究发现鱼类中存在相对保守IFN 天然抗病毒免疫系统[61]，而IRF 作为调控IFN 功能的主要转录因子，当前鱼类中IRF 的功能研究多集中于表达及抗病毒免疫反应，且均在体外使用鱼细胞系进行的[4-6]。尽管IRF 家族蛋白结构较为保守，能够识别相似的DNA 序列，但每个IRF 都有不同的功能角色，其中C 端的IAD 的不同决定了家族成员的功能多样性[57]。研究发现在哺乳动物和鱼类中IRF数量均有所不同，其中家族成员IRF1-9 均保守存在但功能有所不同，IRF10 仅在鱼类和鸟类中报道，IRF11 在鱼类中特有[22]，表明IRF 家族成员在进化过程中可能相对独立。此外，鱼类中IRF 家族成员虽均为组成型表达，但在不同组织的表达具有差异性。如在卵形鲳鲹、鲤等中IRF5 基因在已知的富含淋巴细胞的组织（如头肾和鳃）中表达丰富，而在肝脏、血液、脾脏和肌肉中较差，在斑马鱼中IRF5 基因在肌肉和卵巢中高表达[54,55]；IRF1 基因和IRF2基因在虹鳟的肝脏中不表达，推测不同硬骨鱼中IRFs表达模式差异的原因可能是由于鱼类的多种免疫系统导致[55]。

尽管鱼类IRF 与哺乳动物的IRF 是同源的，但研究发现哺乳动物和鱼类相同IRF 家族成员在病毒感染过程中发挥功能有所不同，如哺乳动物中IRF3 组成型表达，而鱼类IRF3 是典型的ISG，通过IFN 或病毒刺激而上调；哺乳动物IRF4 通过与IRF5 竞争与MyD88 相互作用而成为IFN 表达的负调节因子[62]，而鱼类IRF4 可以作为正调节因子促进IFN 的转录[41]；IRF6 在哺乳动物中不受IFN 表达影响，鱼类中IRF6 是IFN 转录的正调节因子[60]。尽管鱼类IRF 的大部分功能在哺乳动物中是保守的，但仍然存在一些鱼类特有的功能，需进一步体内研究数据支撑。

哺乳动物IRF1/3/5/7/9 主要在抗病毒免疫反应的调节中起激活剂的作用，而IRF4 起负调节剂的作用[62]。然而鱼类中IRF1/3/6/7/9/11 主要作为转录激活因子不断发挥作用，而IRF2/4/5/8/10 是双功能因子，根据靶基因激活或抑制转录来发挥功能[63]。IRF2 属于一类多功能转录因子，其在转录抑制或激活中的特定作用取决于细胞类型和炎症状态[10]，草鱼IRF2 能够与IFN 的启动子结合下调IFN 基因的转录活性[19]，而卵形鲳鲹IRF2 基因正调控IFNa3和IFNγ 基因的转录表达[20]，而在青鳉中发现IRF2基于表达的持续时间而具有抗病毒或促进病毒复制的双面性[64]。IRF3 既可以通过促进IκBα 降解来增强NF-κB 的活性[34]，又能够负调控TRIF 进而抑制的NF-κB 信号通路[36]。鱼类IRF8 具有多种功能，是IFN1 表达的负调节因子。在体外试验中，IRF8 基因能够在体外上调IFNr 基因的表达[48]，也能抑制NF-κB 信号通路的激活，以防止体外过度免疫损伤[33]。在斑马鱼和斜带石斑鱼中IRF10 基因能够抑制IFNφ1 和IFNφ3 基因启动子的激活，并负调控鱼类抗病毒基因的表达，这是硬骨鱼中IFN反应的独特调节机制[47]。

4 问题与展望

显然，哺乳动物和鱼类中IRF 家族成员的作用和作用的多样性需要一些澄清，尤其是关于IRF 家族成员在病毒或细菌感染后的免疫反应中所起的作用以及IRF 家族成员个数等的不同。当前越来越多的鱼类IFN 负调节因子被发现，说明鱼类也存在一个庞大而复杂的IFN 反应平衡系统，保证了免疫的相对平衡，防止过度免疫造成严重损害，进一步研究IRF 家族的功能有助于促进鱼类IFN 抗病毒免疫机制的理解。