宫腔灌注自体外周血单个核细胞改善反复种植失败患者的妊娠结局*

刘 珊,贾 君,高艳霞,吴园园,刘荣娜,程立立,吴小华*

(1.中国人民解放军联勤保障部队第980医院 a.生殖医学科;b.妇科,石家庄 050000;2.河北医科大学第三医院生殖医学科,石家庄 050051;3.石家庄市第四医院生殖医学科,石家庄 050000)

近年来,据调查显示我国不孕不育发生率从12%升到18%,人口出生率越来越低,因此越来越多的生育问题亟需解决[1]。目前体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)及其衍生技术已成为治疗不孕症患者最常用的一种助孕方式[2]。随着辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)水平的不断提高,IVF-ET的妊娠率越来越高,累积妊娠率可高达70%,但仍有一部分患者经历着反复种植失败(repeated implantation failure,RIF)。对于RIF,目前国内外尚无统一的诊断标准。2021年欧洲人类生殖与胚胎学学会(European Society of Human Reproductionand Embryology,ESHRE)一项关于RIF的国际调查表示,大多数临床医生和胚胎学家将经历3个新鲜或冻融移植周期,移植至少4枚优质胚胎后未实现临床妊娠定义为RIF[3]。胚胎种植的两大关键因素是胚胎质量和子宫内膜容受性[4]。RIF患者通常具有高质量的胚胎,可能因其子宫内膜容受性差导致胚胎种植失败。因此寻找改善子宫内膜容受性的方法成为提高RIF妊娠率的关键所在。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)是由B淋巴细胞、T淋巴细胞和单核细胞组成的复合细胞[5]。子宫内膜中的巨噬细胞、树突状细胞及参与适应性免疫的调节性T细胞,为胚胎着床提供独特的内分泌-免疫微环境,对胚胎种植起到促进作用[6]。Yoshioka等[7]采用宫腔灌注自体PBMCs的方法显著提高了RIF 患者 IVF-ET 助孕的临床妊娠率和胚胎种植率。但其具体机制尚不清楚,最佳灌注时间不明确。文献报道行宫腔灌注自体PBMCs时间不一致,移植前72h行宫腔灌注[8-9],移植前48h时行宫腔灌注[10],移植前24h行宫腔灌注[11-13]。本研究通过确定胚胎移植前宫腔灌注PBMCs的有效性及最佳宫腔灌注时间,以最少的宫腔操作、最佳的时间行宫腔灌注PBMCs达到最高的妊娠率,进一步解决临床中发生RIF的难题,解决不孕患者的生育问题。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2021年6月至2022年12月在中国人民解放军联勤保障部队第980医院生殖医学科就诊的RIF患者195例。纳入标准:符合RIF诊断标准;年龄≤40岁;血清卵泡刺激素(FSH)<15U/L;至少冻存1个冻胚(囊胚或者卵裂胚),并且其中至少有一个优质胚胎;移植日内膜厚度≧8mm;夫妇双方染色体核型无异常;患者自愿参与研究并签署知情同意书。排除标准:单侧或双侧输卵管积水,宫腔积液者;合并子宫畸形、子宫器质性病变者;合并子宫内膜炎者;合并子宫内膜结核或子宫内膜异位症者。患者根据是否行宫腔灌注治疗分为观察组(105例)和对照组(90例),观察组根据胚胎移植前宫腔灌注时间不同分为3组,胚胎移植前72h宫腔灌注PBMCs为Ⅰ组(35例),胚胎移植前48h宫腔灌注PBMCs为Ⅱ组(37例),胚胎移植前24h宫腔灌注PBMCs为Ⅲ组(33例)。本研究经医院伦理委员会批准,患者知情同意。

1.2 治疗方案

1.2.1 内膜准备 月经周期规律的患者选择自然排卵后行FET术,从月经第8～10日开始监测卵泡和内膜,当卵泡直径≥18mm或促黄体生成素(LH)>20mU/mL时,应用人β绒毛膜促性腺激素(β-HCG,2000U/支,珠海丽珠制药) 6000U诱导排卵,并行内膜转换,排卵后第3日或第5日行FET术,常规行黄体支持。月经周期不规律患者均行激素替代周期FET术,患者从月经来潮第2日或3日起给予戊酸雌二醇片(补佳乐,1mg/粒,广州拜耳) 每次1mg,每日2次口服,每4日增加戊酸雌二醇片2mg直至最大剂量12mg /d,待子宫内膜厚度≥8mm 时给予内膜转化,同时检测血雌激素(E2)和孕酮(P)水平,内膜转化后第3日或第5日予以 FET术,常规行黄体支持。

1.2.2 自体PBMCs分离制备 抽取患者自体外周血30mL,按1∶2比例加外周血淋巴细胞分离液(200mL/瓶,TBD)60mL,3000r/min,离心30min,离心管中由上至下细胞分四层,第二层乳白色液体为淋巴细胞或单核细胞层(PBMCs)。收集第二层细胞沉淀,用生理盐水洗涤2次,用500～800μL生理盐水重悬,将细胞浓度调整为1×107/mL,置于5mL离心管里备用。

1.2.3 自体PBMCs宫腔灌注 观察组胚胎移植前不同时间点行自体PBMCs宫腔灌注。宫腔灌注前嘱患者排空膀胱并取截石位,用生理盐水常规消毒外阴及阴道,用阴道窥器暴露宫颈。用一次性人工授精管连接1mL注射器,抽取已制备好的PBMCs悬液,将人工授精管顺着宫颈口进入宫腔内,缓慢向宫腔内注射。停留数秒后取出人工授精管,嘱患者平卧休息20～30min。

1.3 宫腔镜检查 本中心规定经历两次胚胎移植失败的患者均常规行宫腔镜检查。患者行宫腔镜检查提示无子宫内膜炎、黏膜下肌瘤及子宫内膜息肉等宫腔病变。

1.4 观察指标 患者的一般情况、胚胎移植情况、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率、活产率。观察组各亚组间取卵年龄、不孕时间、体质量指数(body mass index,BMI)、基础卵泡刺激素(FSH)、移植日内膜厚度、移植胚胎类别、移植胚胎数、优质胚胎数、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率、活产率。临床妊娠率=临床妊娠总数/移植周期总数×100% ,胚胎种植率=着床胚胎总数/胚胎移植总数×100% ,早期流产率=流产的周期总数/临床妊娠周期总数×100%,活产率=活产总数/移植周期总数×100%。移植后第12日或第14日血β-HCG>25mU/mL为生化妊娠,移植后4周超声下看到孕囊为临床妊娠,孕12周之前流产记为早期流产,异位妊娠计入流产总数内,胎儿平安生产计入活产总数内。

2 结 果

2.1 患者一般情况 观察组和对照组患者的取卵年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、原发不孕率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。观察组分为3个亚组,各亚组的取卵年龄、不孕年限、BMI及基础FSH比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。对照组和观察组中原发不孕者分别有52例(57.8%)和56例(53.3%),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者中均无任何不良反应发生。

表1 两组患者一般情况比较

2.2 患者移植情况 观察组和对照组的移植日内膜厚度、移植胚胎类别、移植胚胎数及优质胚胎数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组分为3个亚组,各亚组移植日内膜厚度、移植胚胎类别、移植胚胎数及优质胚胎数相比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组患者移植情况比较

2.3 患者临床结局 对照组中90例患者行胚胎移植术,26例患者达到临床妊娠,其中单胎妊娠20例,双胎妊娠6例。4例发生孕早期流产,其中1例异位妊娠行腹腔镜下开窗取胚,1例孕5周自然流产,2例孕6周因胚胎停育行清宫术。1例患者孕26周双胎妊娠流产。观察组中105例患者行胚胎移植术,47例患者达临床妊娠,其中单胎妊娠36例,双胎妊娠11例。5例患者发生早期流产,其中2例孕6周发生自然流产,2例孕7周因胚胎停育行清宫术,1例因外力发生流产。2例患者孕中期双胎妊娠流产。观察组的临床妊娠率、胚胎种植率及活产率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组的早期流产率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组分为3个亚组,各亚组的临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率及活产率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 两组患者临床结局比较

3 讨 论

RIF国内外尚无统一的诊断标准,目前沿用最多的定义是40岁以下不孕患者至少经历3个新鲜或解冻移植周期累计至少4枚优质胚胎而未能实现临床妊娠[14]。RIF的发生率约高达10%,不仅给患者带来了很大的心理及经济负担,还会引起一系列社会问题。因此,RIF是生殖医学领域研究的重点与难点。RIF的病因复杂,涉及遗传、内分泌、免疫、子宫微环境及血栓前状态等多方面,如何筛查病因、针对性处理及改善反复IVF-ET 失败患者妊娠结局具有重要的临床意义[15]。胚胎成功着床是个非常复杂的过程,良好的滋养细胞层细胞侵袭力、子宫内膜容受性及母-胎免疫界面稳态是种植成功的关键[6]。研究显示,2/3以上的RIF患者胚胎种植失败与子宫内膜容受性异常有关,因此改善子宫内膜容受性成为治疗RIF的重点[16]。PBMC是圆形单个核的外周血细胞的总称,主要由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞组成,单个核细胞在体积、形态、比重等方面与其他外周血细胞有明显差异[17]。研究表明,PBMC可使白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、整合素αvβ3等胚胎种植相关因子表达量增加,促进胚胎滋养细胞侵入子宫内膜,有利于胚胎的种植[18]。宫腔灌注 PBMCs 使得宫腔内发生有利于胚胎侵入的炎症反应,其分泌的细胞因子在胚胎着床、维持妊娠中可能发挥着关键作用[19]。有研究认为,PBMCs 有助于调节 Th1/Th2失衡,以Th2型免疫反应为主,调节子宫内膜局部免疫状态,改善了子宫内膜的容受性,促进了胚胎的种植,这在一定程度上提高了RIF患者的胚胎移植成功率[20]。

宫腔灌注是一种临床中经常用的直接作用于子宫内膜局部的给药治疗方法,子宫腔属于半开放性质的黏膜组织,宫腔灌注不直接进入血液循环,而在黏膜系统中进行吸收,相对于静脉回输安全性更高。因其更直接、安全、有效且无创易被患者接受,是目前女性生殖领域临床研究使用较多的辅助治疗手段[21]。本中心既往沿用皮下注射丈夫外周血单个核细胞提高RIF患者的妊娠率,此法需多次注射,耗时长,且存在注射部位疼痛、血源性病毒交叉感染等副作用。本研究改进以往方法,在胚胎再次移植前24～72h行宫腔灌注RIF患者自体PBMCs用于改善RIF患者的妊娠结局,此法操作简单,一次完成,安全无创,患者依从性好。结果发现,宫腔灌注PBMCs后能明显提高患者的临床妊娠率和胚胎种植率,早期流产率及活产率无明显差异。观察组各亚组中胚胎移植前48h行宫腔灌注组的临床妊娠率、胚胎种植率及活产率达到最高,早期流产率最低,差异均无统计学意义。PBMCs 作为重要的免疫细胞,其分离后的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等可能改变了宫腔局部免疫环境,使胚胎种植相关细胞因子发生改变,这一变化可能在宫腔灌注后48h时达到新的平衡并促进胚胎黏附、植入并且种植,这需进一步扩大样本量进行验证。 自体PBMCs在分离的技术操作中可能出现微生物感染,宫腔操作导致患者临床感染等风险。本研究在分离外周血PBMCs和临床操作过程中均严格执行无菌操作,对使用过的器皿和注射器均行微生物培养,未发现病菌生长,且本实验所有患者行自体PBMC灌注治疗后无一例出现感染症状。本研究中所有出生活婴中未发现该项治疗方式对子代发育有不良影响。

综上所述,宫腔灌注药物已成为治疗RIF的一个新的思路,本研究中自体PBMCs宫腔灌注可改善RIF患者的临床结局。但本研究样本量偏少,还需大样本、多中心的临床实验来确定最佳的灌注时机、剂量,治疗指征及治疗效果还需更多、更严谨的研究加以确定及规范,PBMC具体作用机制有待进一步深入的探讨和研究。