优势菌挂膜法处理切削液废液的研究

摘 要：利用优势除油菌，通过挂膜的方式吸附在聚氨酯海绵填料中，直接处理切削液废液。通过水质检测仪、金相光学显微、宏基因分析等手段，研究微生物挂膜过程、含油废水降解情况，并分析了挂膜完成后好氧反应器中微生物物种分布特征。结果表明，在19 d优势菌可挂膜成功，挂膜完成后COD、NH3-N、TP降解率均可达60%左右；好氧反应设备中优势物种为固氮螺菌属、动胶菌属等。微生物群落与环境存在复杂的交互关系，主要包括代谢物交换、代谢物产生、信号传导等。

关键词：微生物挂膜；好氧处理；切削液废水；群落结构

中图分类号：X703 文献标志码：A 文章编号：1673-9655（2024）04-00-07

0 引言

在整个21世纪，切削加工是机械制造业的主导加工方法，约占整个机械加工工作量的90％以上。机械加工过程中，切削液的引入能有效降低加工区域的摩擦热以及变形热，延长了刀具寿命并保证了工件的表面质量[1]。切削加工中产生大量的切削液废液对环境和人体所产生的危害已成为我国发展高端制造和跨入制造强国的瓶颈问题[2]。

目前切削液废液的现场处理方法有：物理法[3， 4]、化学法[5]、生物法[2， 6]等。物理法处理切削液废水效果不佳，而化学法处理成本较高，微生物处理技术因其无二次污染而成为研究热点，目前，生物处理技术已被证明在工业废水处理中发挥着重要作用[7， 8]。废切削液经生物处理常用的方法为好氧生物处理法，一般经过好氧生物处理后水质较好，出水水质较为稳定[9]，好氧生物处理是通过好氧微生物的代谢来降解污染物。利用好氧微生物的新陈代谢等作用对污染物进行降解，根据微生物生长的载体不同，可分为活性污泥法和生物膜法[10， 11]。活性污泥法出水水质好，且运行费用低，在运行管理上比较灵活、好操控；但是也存在很多问题，相较于生物膜法，活性污泥法动力消耗和占地面积大，剩余污泥多。生物膜法则更耐冲击，设备的占地面积小，世代周期长的微生物也可以生存。对于好氧悬浮填料生物膜工艺通常采用自然挂膜法[12]、活性污泥挂膜法、加入优势菌挂膜[13]。目前，已有文献资料主要集中在活性污泥挂膜法及其改进，对优势菌挂膜过程的报道较少。另外，目前除油菌的使用主要集中在餐饮废水[14]、采油废水[15]、海洋油污染废水[16]等的处理，未有利用活化的除油菌菌剂作为菌液种子进行聚氨酯海绵填料挂膜，处理切削液废液的说明。

本文利用优势除油菌，通过优势菌挂膜的方式吸附在聚氨酯海绵填料中直接处理切削液废液。文中详细地介绍了挂膜过程中的实验参数和实验条件，并利用水质检测仪、金相光学显微、宏基因分析等手段，研究了微生物优势菌挂膜过程、含油废水的降解情况，最后通过宏基因技术分析了挂膜完成后好氧反应器中微生物物种分布特征。

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

1.1.1 菌液种子

菌液种子按照活化剂：菌粉：水=1：10：100比例配制。菌粉为BioPower系列微生物菌剂，活化剂为BioNutrition 菌种活化剂。BioPower系列微生物菌剂均由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室开发，主要成分为芽孢杆菌、假单胞菌及其营养剂等，有效活菌数≥50亿/g；产品性状：褐色固体粉末；适用范围：适用于各类含油废水，如采油废水、石化废水、食堂废水以及油脂类食品加工废水等；产品功能：针对性分解油脂类、脂肪烃、芳香烃，能快速消除水体表面的油脂，解除油污对污水活性的抑制，快速降低出水含油量，提高污水整体系统COD的去除率。

1.1.2 处理液

好氧反应器进液为切削液废液稀释水。切削液废液取自东莞某机械加工厂，切削液COD浓度在12万～15万mg/L左右。进液初始稀释比设置1：100。

1.1.3 改性的聚氨酯海绵材料

聚氨酯海绵材料经改性后，除物理吸附外，载体表面还带有一定的阳离子活性基团及羟基等亲水性基团，可以将微生物等固定在载体上，不易在剪切力作用下流失[7]。聚氨酯海绵填料，呈多孔网状结构，各气孔均匀贯通，孔隙率达97%以上，比表面积大，可作多方位培菌载体，不易堵塞[18， 19]。好氧池填料体积投加率按总体积50%计算，单个海绵填料体积为2×2×2 cm3。

1.2 实验设备

实验室自主设计的好氧反应设备见图1。设备上端为曝气泵及气体流量计，设备底部放置曝气盘。好氧反应器中加入50%聚酯海绵填料后，加入清水加入容积1%的菌液种子闷3 d后，进模拟废液。设备运行参数设置为：①设计初始进水水力停留时间16 h；②溶解氧（DO）质量浓度控制在1.5～4 mg/L [20]；③温度：最适28～35℃；④pH：7～8，好氧池最适pH应为7～8[21]；⑤盐度：≤30000 mg/L。

2 分析方法

2.1 生物膜量测定方法

①取出2～3个海绵填料，浸泡在超纯水中，洗去可逆附着成分（非生物膜部分）；②在103～105℃条件下烘干4 h至质量恒定，称得质量m1；③将填料置于0.1 mol/L NaOH碱液中超声30 min，机械剥离处理，用超纯水洗净；④再次烘干4 h，称得质量m2。m2与m1之差除以填料单位数即为单个填料上的生物膜量。

2.2 挂膜情况测定

在好氧池启动的5 d，12 d，19 d分别检测挂膜情况：将填料在103～105℃条件下烘干4 h后，采用金相光学显微镜WYJ-55XA显微镜（放大100倍）观察挂膜情况。

2.3 生物膜絮体镜检

在好氧池启动的5 d、12 d、19 d分别取海绵填料絮体，采用金相光学显微镜WYJ-55XA显微镜（放大100倍）观察填料内絮体生长状况。

2.4 水质分析

DO采用DO便携式分析仪分析；细菌数数目利用紫外可见分光光度计（UV-Visible Spectrophotometer）检测OD600；表面/界面张力仪DCAT 25测定废油液的表面张力及密度；水质含油量采用SH-21A系列红外测油仪进行检测[22， 23]。

COD采用重铬酸钾氧化法（GB 11914—89）[24]，氨氮分析采用纳氏试剂分光光度法（HJ 535—2009），硝酸盐氮分析采用紫外可见分光光度法（HJ/T 346—2007），TP采用过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法（GB 11893—89）进行检测。水质检测前需进行离心过滤预处理，以便去除检测液中的悬浮物和菌体[25]。

2.5 宏基因检测

取好氧反应器中海绵填料挤压得到含菌液，含菌液经高速离心富集后取下层沉淀送北京诺禾致源科技股份有限公司进行宏基因检测。宏基因检测的步骤主要包括样品DNA提取—琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析DNA的纯度和完整性—Qubit对DNA浓度进行精确定量—文库构建—Agilent2100对文库的insert size进行检测—上机进行Illumina PE150测序—下机质控—从gene catalogue出发，和MicroNR库进行比对，获得每个基因（Unigene）的物种注释信息，并结合基因丰度表，获得不同分类层级的物种丰度表，分析优势菌挂膜成功后，好氧反应器内微生物菌落在不同层级的物种分布特征。

3 实验结果

3.1 切削液废液性质

取切削液废液检测其中主要污染物浓度，每组实验平行检测3次，增加实验准确性，检测结果见表1。切削液废液COD平均浓度为124160 mg/L，NH3-N平均浓度为4261 mg/L，TP平均浓度为175 mg/L。废液密度为7.1233 g/m3，pH碱性，油水混合体系为O/W体系。使用表面/界面张力仪DCAT 25测定废油液的表面张力及密度，得到在T=25.3°C，体系表面张力SFT=30.98±0.028 mN/m。

切削液废液密度为7.1233 g/m3。水质含油量采用SH-21A系列红外测油仪进行检测，得到切削液废油液的含油量为5360 mg/L。

3.2 除油优势菌挂膜过程表征

3.2.1 表观形貌变化

观察启动过程中海绵填料表观形貌变化见图2。图中可见好氧反应器启动5 d，海绵填料内部形成透明淡黄色生物膜；好氧反应器启动12 d，海绵填料内部仍透明，但黄色加深；好氧反应器启动15 d，海绵填料内部形成黄褐色不透明生物膜；好氧反应器启动19 d，海绵填料内部形成黑色生物膜。挂膜完成后，测定水中OD600的值在0.727～1.106，细菌数可达109 cfu/mL。马睿莉等[17]使用聚氨酯海绵填料进行优势菌挂膜，可在21 d内完成挂膜。挂膜完成后聚氨酯海绵填料内部可形成小型厌氧区域，好氧池内同时进行好氧、厌氧反应。

3.2.2 生物量测定结果

取出2个海绵填料，浸泡在超纯水中，洗去可逆附着成分后，在103～105℃条件下烘干4 h至质量恒定。将填料置于0.1 mol/L NaOH碱液中超声30 min，机械剥离处理，用超纯水洗净再次烘干4 h至质量恒定。通过2次质量差除以填料单位数即为单个填料上的生物膜量。生物量测定结果见表1。

好氧反应器启动5 d后，实际单个海绵填料生物量为0.08±0.001 g；好氧反应器启动12 d后，实际单个海绵填料生物量为0.11±0.005 g；好氧反应器启动19 d后，实际单个海绵填料生物量为0.125±0.005 g。

3.2.3 絮体金相显微镜镜检结果

好氧反应器启动5 d、12 d、19 d分别取海绵填料絮体，采用金相光学显微镜WYJ-55XA显微镜（放大100倍）观察填料内絮体生长状况，检测结果见图3海绵填料絮体镜检图。从图中可以看出原海绵填料呈多孔网状结构，各气孔均匀贯通，比表面积大，可多方位负载微生物。好氧反应器启动5 d时，填料内絮体较少，仅在部分网状结构表面负载生物膜。好氧反应器启动12 d时，填料内絮体增多，絮体体积可占孔体积30%～50%。好氧启动19 d时，填料内生物膜厚度增加，可填满海绵孔隙，颜色呈中间不透明，边缘透明状。取出海绵填料中絮体进行镜检（图4）可以观察到生物膜絮体紧实，不易松散；絮体可聚集油滴，增大油滴粒径。

3.3 运行参数优化

生化系统挂膜初期，进液稀释比设置为1：100。系统稳定运行后，逐步提高进液中切削液废液进液浓度。实验中采用3个不同梯度设置稀释比，依次按不同稀释比进液，运行稳定后检测出水污染物浓度。在不同进液梯度下分析生化系统对COD、NH3-N、TP的降解效果见表2。切削液废液：稀释水比值为1：100时，检测到出水COD浓度大于进水COD浓度，可能是由于切削液废液稀释比高，不可生化降解的物质积累导致。如前期研究得到硼酸及三乙醇胺硼酸盐均为生化处理难降解产物，可在好氧系统中富集。当稀释比1：30时，出水中COD降解率为52.69%、NH3-N降解率为31.45%、TP降解率为35.1%；当稀释比1：10时，出水中主要污染物COD、NH3-N、TP降解率最高可达到70%。根据前期大量预实验经验，仅好氧生化处理切削液废液的最大处理效率为40%～70%，因此后续实验中将稀释比确定为1：10连续进液反应。

3.4 连续运行处理效果分析

按稀释比1：10连续进液，在开始进液后2 h、4h、8 h、24h、48h取样，分别检测出水主要污染物浓度变化。好氧反应进水切削液废液的各项指标为COD 12416 mg/L，NH3-N 426.1 mg/L，TP 17.5 mg/L。出水中主要污染物浓度的变化及去除率见图5。从图5中可以看出好氧反应设备连续运行时，出水COD降解率在64%～69%内波动，NH3-N降解率在63%～70%内波动，TP降解率在56%～68%内波动。

3.5 微生物群落分析

好氧反应设备稳定运行后检测其中微生物群落在门、属、种层级上的优势群落组成，为后续针对切削液废液筛菌提供理论依据，微生物群落分析结果如下。

3.5.1 门水平的优势菌群分布特征

门水平上好氧反应器内微生物物种分布如图6所示。门水平占优势的菌群变形菌门（Pseudomonadota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、弯曲杆菌门（Campylobacterota）、厚壁菌门（Bacillota）、热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteria）和脱铁杆菌门（Deferribacteres）等。其中变形菌门（Pseudomonadota）占总群落数的61%，在细菌群落中占比64%。拟杆菌门（Bacteroidetes）占总群落数的9%，在细菌群落中占比9%。弯曲杆菌门（Campylobacterota）占总群落数的6%，在细菌群落中占比7%；厚壁菌门（Bacillota）占总群落数的5%，在细菌群落中占比5%。此外，热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteria）和脱铁杆菌门（Deferribacteres）均分别占总群落数的4%，占细菌群落的4%。

3.5.2 属水平的优势菌群分布特征

图7为好氧生化系统优势属分析。从图中可知，占比前三的优势属分别为固氮螺菌属（Azospirillum）占总群落数的8%、动胶菌属（Zoogloea）占总群落数的7%、食酸菌属（Acidovorax）占总群落数的7%。分析各属进化关系得：固氮螺菌属（Azospirillum）属于变形菌门（Pseudomonadota）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、红螺菌目（Rhodospirillales）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）。动胶菌属（Zoogloea）属于变形菌门（Pseudomonadota）、β—变形菌纲（Betaproteobacteria）、红环菌目（Rhodocyclales）、红环菌科（Rhodocyclaceae）。食酸菌属（Acidovorax）属于变形菌门（Pseudomonadota）、β—变形菌纲（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）。综合上述分析得，切削液废水生物处理过程中发挥作用的主要细菌种类均属于变形菌门。

3.5.3 TOP10群落种分布特征

种水平上好氧反应器内微生物物种分布如图8所示，从图中可以得到好氧反应设备中参与降解切削液废液的微生物优势物种为Sphingomonadales bacterium、Acinetobacter rudis、Seleniivibrio woodruffii、Acidovorax caeni、Aliarcobacter butzleri、Zoogloea ramigera、Bacteroidia bacterium 43-41、Azospira inquinata、Azospirillum fermentarium、Extensimonas perlucida。其中占比最大的为Azospirillum_fermentarium占总群落数的7%，该菌属于变形菌门（Pseudomonadota）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、红螺菌目（Rhodospirillales）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）、固氮螺菌属（Azospirillum）。Zoogloea_ramigera占总群落数的5%，该菌属于变形菌门（Pseudomonadota）、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、红环菌目（Rhodocyclales）、红环菌科（Rhodocyclaceae）、动胶菌属（Zoogloea）。

3.6 群落基因功能分析

利用KEGG数据库分析微生物群落的生物代谢通路见图9a；样品在eggNOG数据库中level1层级上的TOP10基因相对功能丰度统计图见9b。从图中分析得，好氧反应器除油优势菌挂膜成功后，设备内微生物菌落基因的主要功能包括：翻译、核糖体结构和生物发生；碳水化合物运输和代谢；无机离子运输和代谢；转录；信号传导机制；细胞壁/膜/包膜生物发生；能源生产和转换、复制、重组和修复；氨基酸运输和代谢。微生物群落的生物代谢通路结果显示群落基因5.1%与细胞过程相关、6.8%与环境信息处理相关、4.7%与遗传信息处理相关、2.2%与人类疾病相关、1.8%与新陈代谢相关、1.3%与生物体系统相关。综合分析得，挂膜成功后的微生物群落与环境存在复杂的交互关系，主要包括代谢物交换、代谢物产生、信号传导等。

4 结论

（1）进水所用的切削液废液COD含量高，削液废液中出现得可检测得化合物种类共52种，主要物质包括醇类、胺类、醚类、酸酯、羧酸、硼酸、醋酸、烃类等。

（2）除油优势菌挂膜完成后好氧反应器内形成黑色生物膜，OD600的值在0.727～1.106，COD、NH3-N、TP降解率可达到60%以上。对微生物絮体进行镜检可以观察到生物膜絮体紧实，不易松散。絮体具有聚集油滴，增大油滴粒径的作用。

（3）切削液废水生物处理过程中发挥作用的主要细菌种类均属于变形菌门；好氧反应设备中微生物优势菌属TOP3分别为固氮螺菌属、动胶菌属、食酸菌属；优势种为Azospirillum_fermentarium和Zoogloea_ramigera。微生物群落与环境存在复杂的交互关系，主要包括代谢物交换、代谢物产生、信号传导等。

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