SSR分子标记两种电泳方法在水稻品种上应用的比较

摘 要：为了研究聚丙烯酰胺电泳和毛细管电泳在水稻分子检测中的应用，以水稻品种为材料，分别使用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测和毛细管电泳检测，并对2种电泳进行比较分析。结果表明，聚丙烯酰胺凝胶电泳对少量样本检测和引物筛选时更经济适用，毛细管电泳检测结果适用于指纹图谱和高通量材料的检测分析，试验中可以根据不同要求选择不同的电泳方法。

关键词：水稻；SSR分子标记；聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳

中图分类号：S511 文献标志码：B 文章编号：2095–3305（2024）05–00-03

水稻是人类重要的粮食作物之一，也是中国农业史上的重要里程碑之一，它不仅解决了中国粮食安全问题，还为农业现代化的发展提供了坚实的基础。我国是世界上水稻产量最高的国家，也是稻作历史最悠久、水稻遗传资源最丰富的国家之一。

当下，世界上可能有超过14万个水稻品种，科学家仍在不停地选育新稻种，水稻品种数量逐年增多，品种之间的差异性也越来越小，传统的检测方法难以区分众多品种，使种子检测工作受到一定限制。近年来，分子标记不断发展，基因水平检测已经广泛用于种子领域。SSR分子标记是从DNA水平上检测生物个体差异，具有多态性高、稳定性强、重复性好、操作简单、技术成熟、不受环境影响等特点，可以快速区分品种，在水稻种子鉴定研究中得到了广泛应用。

毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。通过软件分析数据，比较其峰值差异，可以实现多样品、多位点同时检测，是一种高效、快速、准确的SSR标记检测方法。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳为网状结构，具有分子筛效应。它有非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）2种形式。

聚丙烯酰胺凝胶电泳经染色、显影后，可以分析胶带，是一种适用范围比较广的检测方法。本实验对毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了比较[1-5]。

1 材料与方法

1.1 种子发芽

随机选取超过200粒水稻种子，放入发芽盒中，放在30 ℃光照8 h、黑暗16 h的发芽箱放置6 d左右。

1.2 DNA提取

准备96孔深孔板并在每个深孔板中放入磁珠，再随机选取水稻幼苗单株3 cm左右，用镊子夹住幼苗中间放入96孔深孔板中，盖上盖子，并写上每个样品登记号，放入低于-20 ℃冰箱冷冻1 h。冷冻结束放在研磨仪研磨1.5 min，用冷冻离心机离心2 min。每个孔中加入300 μL 65 ℃的提取液和150 μL的乙酸铵溶液，盖上盖子，再用研磨仪研磨1 min，放入4 ℃冷冻离心机离心10 min。用300 μL的移液器吸上清液200 μL至另一深孔板，并做好标记。加入400 μL的冰无水乙醇，换干净的盖子盖上并充分摇匀。放入4 ℃冷冻离心机离心15 min，去掉上清，晾干，加入80～200 μL的双蒸水，放置4 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物筛选

选用《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》（NY/T 1433—014）标准中推荐的SSR引物。

1.4 PCR扩增检测

PCR反应体系为：11 μL的反应体系包括DNA提取液2.0 μL、Buffer 1.0 μL、dNTP 0.8 μL、MgCl2 0.6 μL、正反引物各1 μL、双蒸水4.35 μL、Taq聚合酶（0.25 μL）。

PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，31个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，放入4 ℃冰箱中保存备用。经过30多个循环后，单个SSR位点特定片段可得到几百万倍的扩增，从而可在凝胶上显现出来。

1.5 PCR产物检测

1.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

将扩增好的产物加入2 μl溴酚蓝指示剂，在3%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，用2把1.0 mm 52孔密型点样梳点样96个样品；在400 V、400 mA的条件下，电泳35 min，电泳结束后，将凝胶从板子上放入盆中，加入固定液和银染液（双蒸水800 mL+乙酸4 mL+乙醇80 mL+1.6 g硝酸银）染色10 min左右，显影加入800 mL双蒸水和12 g NaOH和4 mL的甲醛溶液摇动至显示出清晰的条带，最后加入水漂洗8次，冲洗凝胶上的残留液，人工判读。

1.5.2 毛细管电泳检测

PCR反应程序结束后，在做好标记的PCR中加入60 μL双蒸水，再加PCR扩增产物2～4 μL，混合离心，在96孔板中分别加入分子量内标、HIDI、稀释混合的PCR产物2 μL，用3730XL毛细管分析仪进行电泳。得出数据用软件分析并生成分型信息和峰图。

2 结果与分析

2.1 2种电泳方法检测结果的比较

毛细管电泳检测比聚丙烯酰胺凝胶电泳检测更为精准，毛细管电泳检测可以将相差1 bp的DNA片段分离开，各样品中含有分子量内标可以直接与DNA片段大小相比，再通过不同的峰值图清晰、准确地展示出来（图1）。聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA片段是通过与已知分子量Marker进行比较，估计DNA片段的大小。水稻品种在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度谱带如图2所示。

2.2 2种检测方法成本和效率的比较

第一，仪器成本比较。毛细管仪器3730XL、ZAG等仪器成本要高于聚丙烯酰胺凝胶电泳成本，毛细管电泳的试剂盒、荧光引物、耗材、仪器维护成本也略高，对实验室的温度、电源、洁净度、实验人员都有一定的要求。

第二，效率比较。毛细管电泳采用多个PCR产物混点多重电泳（图3），提高了工作效率，缩短了电泳时间，且毛细管电泳是全自动化操作，省去了人力，也避免了人为操作的误差，从而提高了实验结果的可靠性。建议在实验中可以将这2种方法有效地结合起来，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法筛选SSR标记，对少量材料进行检测，对大量材料的检测分析和指纹图谱建立时用毛细管电泳检测法完成。

3 讨论

3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳变性与非变性电泳的比较

聚丙烯酰胺凝胶电泳有变性与非变性电泳，2种电泳均能检测出目的片段，但方法不一样，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳需要加变性剂，操作过程也较为复杂，制胶时要用剥离硅烷擦拭凹板，用亲和硅烷擦拭平板，凹板和平板固定之后再灌胶，电泳时对PCR扩增产物要进行变性处理，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶非常薄，染色时需要黏附在胶板上进行染色，所以染色需要一块胶一块胶地进行，并且凝胶从玻璃板上脱离需要用NaOH浸泡，不安全也不卫生。因此，整个电泳过程时间长、效率低、不环保。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作过程相对简单，在制胶时无需对胶板进行处理，直接组装玻璃板灌胶，电泳时不需要对PCR扩增产物进行变性处理，染色时可以直接对凝胶进行染色，因此，检测通量高，整个电泳检测过程时间短、工作效率高。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法操作过程烦琐、成本高、耗时耗力、效率低。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作简单、污染小、成本低、经济快速，非常适合分子标记检测，例如，品种的纯度鉴定、真实性鉴定、DNA比对、分子遗传多样性研究[6-7]。

3.2 不同DNA提取方法的比较

SSR分子标记DNA提取方法一般采用快提法[8]、SDS法、CTAB法、磁珠法。快提法比较简单快速，但保存时间短，一般不超过一个星期，扩增产物在毛细管电泳检测效果也不好，电泳受限制。SDS法和CTAB法虽然提取的DNA质量较高，但在提取过程中需要加氯仿和异戊醇，这2种试剂有刺鼻性气味，对人体有害且不安全。磁珠法提取种优化的SDS提取方法，DNA质量高，用核酸蛋白仪检测DNA的浓度在200 ng/μL左右，DNA质量在OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之间，适合任何电泳，在提取的过程也不需要加氯仿和异戊醇，只需要加裂解液BUFFER1、提取液BUFFER2和无水乙醇，因此，较为安全，DNA保存时间也很长，成本较低，经济适用，还可以用96深孔板高通量进行提取，尤其是水稻品种需要大批量提取DNA时优势明显。

3.3 PCR产物混点组合建立

建立一套理想的PCR产物混点组合是保证实验成功及获得准确数据的关键。PCR产物混点毛细管电泳是根据荧光标记引物的颜色、产物大小、引物特点、峰图对PCR产物进行组合选择，每组引物数量为5～11对，相同颜色的引物选择1～3个。

参考文献

[1] 郑戈文.农作物种子检测中常用电泳方法的比较分析[J].中国种业，2018（11）：35-37.

[2] 孙新立，才宏伟，王象坤.水稻同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳方法探索[J].中国水稻科学，1996（1）：43-50.

[3] 胡依依，隋正红，彭冲，等.聚丙烯酰胺凝胶与毛细管电泳检测龙须菜SSR位点的比较研究[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2018，48（3）：65-72.

[4] 郝晨阳，王兰芬，贾继增，等.SSR荧光标记和银染技术的比较分析[J].作物学报，2005（2）：144-149.

[5] 孙国栋，李爱丽，赵仲凯，等.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测新疆特种乳中掺加的牛乳[J].中国乳品工业，2023，51 （6）：50-56.

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[7] 康亮珠，李飞，陈薇兰，等.水稻品种DNA指纹图谱构建及品种纯度的快速鉴定[J].杂交水稻，2024，39（2）：29-37.

[8] 李婧婧，付求来，戴继侠，等.一种快速鉴定杂交水稻种子纯度的方法[J].种子，2018，37（4）：125-126，131.

基金项目：国家重点研发计划项目（2023YFD1201204）。

作者简介：刘奇燕（1982—），女，安徽岳西人，中级农艺师，主要从事种子质量分子检测和常规检测工作。