离子色谱法测定肝素钠总己糖胺中半乳糖胺含量的方法研究

【摘要】目的：建立肝素钠总己糖胺中半乳糖胺含量的检测方法。方法：将标准品及供试品在100℃下水解6 h，使用戴安ICS5000型离子色谱仪，以14 mm氢氧化钠溶液为淋洗液在0.5 mL/min流速下，经戴安氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm）、PA20型色谱柱（150 mm×3 mm）分离，进入配备Au工作电极、pH-Ag-AgCl参比电极的安培检测器中进行检测。结果：经不低于6 h水解，供试品充分水解，空白溶液无干扰峰，水解标准溶液色谱图中，理论板数、分离度、拖尾因子等均符合USP〈831〉的规定，半乳糖胺的检测限和定量限分别达到2 ng/mL、4 ng/mL，半乳糖胺在4～160 ng/mL浓度范围内线性良好，平均加样回收率达到101.2%，RSD为2.64%，水解标准溶液和水解供试品溶液放置24 h，检测结果的RSD为1.53%。结论：方法专属性、系统适用性、线性、灵敏度、回收率良好，适用于肝素钠总己糖胺中半乳糖胺含量的检测。

【关键词】肝素钠；离子色谱；半乳糖胺

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.04.005

Determination of Galactosamine in Total Hexosamine of Heparin Sodium by Ion Chromatography

MI Wenqiang1，3， REN Fengzhi1，3， LIU Jianfen2，3*， ZHANG Xiangbin2，3， WANG Caixiao2，3， LI Lele2，3

（1.North China Pharmaceutical Group Corporation New Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shijiazhuang 052165， China； 2. North China Pharmaceutical Huakun Hebei Biotechnology Co.， Ltd.， Shijiazhuang 050000， China； 3.Hebei Multi-component Biochemical Drug Preparation Technology Innovation Center， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine. Methods： The standard and test samples are hydrolyzed at 100°C for 6 hours， and then analyzed by Dionex ICS5000 ion chromatograph， using 14 mm sodium hydroxide solution as eluent at a flow rate of 0.5 mL/min， passing through Dionex amino acid trap column （50 mm×4 mm） and PA20 column （150 mm×3 mm）， and entering the amperometric detector equipped with Au working electrode and pH-Ag-AgCl reference electrode. Results：After hydrolysis for no less than 6 hours， the test samples are fully hydrolyzed， and there is no interference peak in the blank solution. In the chromatogram of the hydrolyzed standard solution， the theoretical plate number， separation degree， tailing factor， etc. all met the requirements of USP<831>. The detection limit and quantitation limit of galactosamine were 2 ng/mL and 4 ng/mL， respectively. Galactosamine had good linearity in the concentration range of 4～160 ng/mL， the average recovery rate was 101.2%， and the RSD was 2.64%. The RSD of the test results of the hydrolyzed standard solution and the hydrolyzed test sample solution placed for 24 hours is 1.53%. Conclusion：The method has good specificity， system suitability， linearity， sensitivity， and recovery rate， and is suitable for the determination of galactosamine content in heparin sodium total hexosamine.

Keywords： heparin； HPIC； galactosamine

肝素在临床上广泛用于肾脏透析、心脏外科手术、预防或治疗血栓栓塞性疾病，以及血液透析和体外血液循环过程中的抗凝血[1-2]。肝素是一种提取自动物组织的抗凝血药物，属于糖胺聚糖家族的一员，由不同硫酸化多糖链的异质混合物组成，主要的工艺相关杂质如硫酸皮肤素和硫酸软骨素均含有半乳糖胺的糖胺聚糖[3]。研究表明，半乳糖胺可通过消耗肝细胞中的磷酸尿嘧啶，造成蛋白合成紊乱，最终导致肝细胞损伤，引发肝纤维化、急性肝损伤，甚至肝衰竭[4-7]。美国药典规定了半乳糖胺的限度，而中国药典对其尚无要求。

1材料与方法

1.1材料

仪器设备：戴安ICS 5000离子色谱仪，脉冲安培检测器，XA105型电子分析天平（瑞士Mettler公司），RephiLe G超纯水机（上海乐枫公司）。

试剂：盐酸半乳糖胺对照品（含量0.998 mg/mg，批号：G1L378，USP）；盐酸葡萄糖胺对照品（含量0.997 mg/mg，批号：R104K1，USP）；肝素钠原料药（批号：220701，自产）；氢氧化钠溶液（质量分数50%，批号：SS254-1，美国Thermo Fisher公司）；盐酸（批号：20220427，北京化工厂）；超纯水（超纯水机制备）。

1.2方法

1.2.1检测方法

1）色谱条件。色谱柱：AminoTrap氨基酸捕集柱（50 mm×4 mm，10μm），CarboPac PA20分析柱（50 mm×3 mm，6μm）；柱温：30℃；淋洗液：氢氧化钠溶液（14 mmol/L）；Au工作电极；pH-Ag-AgCl参比电极；流速：0.5 mL/min；进样体积10μL；标准糖四电位波形，见表1。

2）溶液配制。水解标准溶液：含半乳糖胺对照品、葡萄糖胺对照品分别为8μg/mL、0.8 mg/mL的盐酸（5 mol/L）溶液，100℃下保温6 h，用超纯水稀释100倍即得；供试品溶液：2.4 mg/mL肝素钠盐酸（5 mol/L）溶液，100℃下保温6 h，用超纯水稀释100倍即得。

1.2.2研究方法

1）水解时长：从水解反应0 h起至水解反应11 h止，每隔1 h取水解标准溶液、水解供试品溶液采集色谱图，记录半乳糖胺、葡萄糖胺峰面积，比较检测结果随时间的变化。

2）专属性：分别取水、盐酸（5 mol/L）、半乳糖胺对照品、葡萄糖胺对照品、供试品，按水解供试品溶液配制方法配制溶液。确定各色谱峰位置。

3）系统适用性：重复6次采集水解标准溶液，考察半乳糖胺与葡萄糖胺的峰分离度、拖尾因子及以葡萄糖胺计算的理论塔板数。

4）灵敏度：规定分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）对应的质量浓度作为半乳糖胺的检出限、定量限。

5）线性与范围：配制系列水解标准溶液，使半乳糖胺浓度为4 ng/mL、8 ng/mL、16 ng/mL、64 ng/mL、120 ng/mL、160 ng/ mL，对应葡萄糖胺浓度为0.39 ng/mL、0.78 ng/mL、1.56 ng/ mL、6.24 ng/mL、11.7 ng/mL、15.6 ng/mL，分别拟合半乳糖胺-浓度、葡萄糖胺峰面积-浓度方程，计算线性回归系数。

6）精密度：平行配制水解标准溶液、水解供试品溶液各6份，检测半乳糖胺限度；变更实验人员，重复测定，计算半乳糖胺限度的RSD。

7）准确度：向供试品中加入80%、100%、120%的半乳糖胺，每比例平行配制3份，测定每份供试品中氨基己糖的半乳糖胺占比，计算回收率及RSD。

8）溶液稳定性：配制水解标准溶液和水解供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进行测定，计算RSD。

9）供试品测定：取肝素钠供试品3批（220701，220702，220703）进行检测。

2结果

1）水解时长：不同水解时长GalNR的RSD=3.97%；半乳糖胺占总己糖胺比例的测得值从1 h起逐步下降，在6 h时趋于稳定，见图1。总己糖胺中半乳糖胺比例的RSD（6～11 h）=3.19%，表明经过6 h后，供试品充分水解。

2）专属性：专属性试验色谱图见图2。空白溶液不产生干扰峰，半乳糖胺峰与葡萄糖胺峰分离良好。

3）系统适用性：柱效均大于3500，分离度不小于2.6，拖尾因子在1.00～1.14之间。方法系统适用性良好。

4）灵敏度：当半乳糖胺浓度为2 ng/mL时，S/N≥3.0；当半乳糖胺浓度为4 ng/mL时，S/N≥13.2。因此，检测限为2 ng/ mL，定量限确定为4 ng/mL。

5）线性与范围：在检查范围内，半乳糖胺线性方程为y = 0.0049x - 0.00006，相关系数：0.9997；葡萄糖胺线性方程为y = 2.7356x - 1.6124，相关系数：0.9994。方法线性良好。

6）精密度：精密度试验结果见表2。方法精密度良好。

7）准确度：准确度试验结果见表3。方法准确度良好。

8）溶液稳定性：5组水解标准溶液和水解供试品溶液的测定结果RSD为1.53%，溶液在室温下放置24 h稳定。

9）样品测定：3批肝素钠样品检测结果分别为：0.08%、0.09%、0.09%，均小于1%的限度规定。

3结束语

通过研究水解时间，增强了样品前处理及检测过程的可控性，使肝素中半乳糖胺占总氨基己糖之比的测定方法研究更为完善，经测试自研样品，结果符合规定，本检测方法准确、可靠。

【参考文献】

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[2]田国亮，李有杰.肝素钠对白蛋白检测的干扰实验分析[J].医学信息，2022，35（8）：168-171.

[3]徐俊涛，翟海港，方永卫，等.肝素钠吸附提取工艺优化研究[J].肉类工业，2018（2）：31-34，40.

[4]翟世康.半乳糖胺引起的肝脏损伤[J].国外医学参考资料.药学分册，1975（6）：347-349.

[5]彭先稳.NADPH氧化酶抑制剂减轻脂多糖/右旋半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤[D].重庆：重庆医科大学，2020.

[6]王斌，赖硕林，宋豫皎，等.Cx26在D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤中的表达[J].大理大学学报，2021，6（2）：55-58.

[7]尹瑞英，魏飞力，胡建华.大黄素改善D氨基半乳糖胺造成的L02细胞损伤[J].中西医结合肝病杂志，2023，33（5）：427-429，435.

【作者简介】

米文强，男，1987年出生，高级工程师，硕士，研究方向为天然药物。

通信作者：刘建芬，女，1976年出生，执业药师，学士，研究方向为医药工程，119797212@qq.com。

（编辑：侯睿琪）