猪源不动杆菌分子生物学鉴定及致病性研究

任柯昱，陶 玲

信阳职业技术学院检验技术学院，河南 信阳 464000

不动杆菌属于人兽共患致病菌，在世界范围内分布广泛，多寄生在猪、牛、羊、骆驼等动物以及人类的肠道中。该菌可以引起人和动物的细菌性腹泻、肠炎及肠毒血症等疾病，其中以仔猪腹泻最为严重。近年来，随着生猪养殖规模化和集约化水平的不断提高，生猪养殖过程中由猪肠道疾病造成的经济损失逐年增加，尤其是由猪源不动杆菌所引起的腹泻给养猪业带来了严重的经济损失[1]。鉴于分子生物学技术快速、简便、无创等特点，可以将其用于猪源不动杆菌的快速诊断和监测，因此，本文采用PCR检测法对猪源不动杆菌进行分子生物学鉴定并研究其致病性和致病机制。

1 猪源不动杆菌

1.1 猪源不动杆菌概述

猪源不动杆菌是一种可以引起猪肠炎和腹泻的细菌，它属于不动杆菌属，是一类革兰氏阴性杆状细菌[2]。猪源不动杆菌广泛存在于自然环境中，包括土壤和水源中等。猪源不动杆菌通常以潜伏感染的形式存在于猪体内，特别是集中在生殖器官、淋巴节点、脾脏和关节等部位。被感染的猪可能会表现出发热、食欲不振、消瘦、流产、不育等症状。传播途径包括直接接触被感染的动物、摄入被污染的食物或水源，以及通过胎盘和分娩过程传染给后代。人类与感染的猪接触、食用未经充分加热处理的感染性动物产品或通过呼吸道都会感染猪源不动杆菌。

1.2 猪源不动杆菌的致病性

猪源不动杆菌的致病性主要与其产生的一些特定致病因子和毒力机制有关。致病因子包括细菌胶囊、细菌腺毒素、附着因子以及分泌的其他蛋白质等。这些因子可以帮助菌株抵抗宿主的免疫系统，使菌株进入宿主细胞并引发其病理反应[3]。此外，不同菌株之间的遗传变异和基因调控也会影响其致病性，这是因为不同菌株可能具有不同的致病因子组合和毒力水平。

2 猪源不动杆菌分子生物学鉴定

2.1 鉴定准备

在对猪源不动杆菌进行分子生物学鉴定之前，需要准备以下样品和PCR 仪器。

样品：收集需要进行鉴定的猪源不动杆菌样品，可以是猪体内的组织样品（如肠道组织）、粪便样品、尿液样品等。设定良好的保存条件以保障样品的新鲜度，避免样品受到污染或降解。本研究收集的是A市Q 养殖场所养殖的猪的肠道组织及粪便。

DNA 提取试剂盒：用于从样品中提取猪源不动杆菌的DNA。根据实验室所选用的试剂盒，按照说明书上的步骤进行DNA 提取。

PCR 管和试剂：准备PCR 试剂盒，包括引物、酶、缓冲液等。

PCR 仪器：使用PCR 仪器进行PCR 反应。确保PCR 仪器的工作状态正常，并设置实验所需参数。

除了上述准备工作外，还需要注意：①实验室操作。在开展PCR 实验之前，要确保实验室的整洁和卫生，避免样品受到外源性DNA 污染。最好专门设置一个净化区用于进行PCR 反应。②引物设计。根据猪源不动杆菌的基因序列，选择合适的引物进行PCR 扩增，以确保引物的特异性和准确性。③PCR条件优化。根据实验需要，优化PCR 反应的温度、时间和循环次数等参数，以提高PCR 扩增效率和特异性。④阴性对照。在PCR 反应中设置阴性对照，检测实验过程中的污染情况。

2.2 鉴定方法

PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于快速、准确地检测和鉴定病原体。PCR鉴定方法的基本步骤可分为以下六步：第一，提取模板DNA；第二，引物设计；第三，准备PCR 反应体系；第四，设置PCR 扩增条件；第五，PCR 扩增反应；第六步，检测扩增产物。

PCR 鉴定方法具有快速、敏感、特异性强等优点，已被广泛应用于微生物学研究、临床诊断、食品安全监测等领域。在猪源不动杆菌的鉴定中，PCR可以通过扩增特定基因片段或DNA 序列来确定是否存在该病原体，并且可以与其他相关方法结合使用，以进一步提高鉴定的准确性和可靠性，PCR 反应体系如表1 所示。

表1 PCR 反应体系

反应条件如下：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次，72℃继续延伸10 min，4 ℃无限循环。

2.3 鉴定结果

鉴定结果如表2 所示。

表2 PCR 鉴定结果

在本次样品PCR 分子生物学鉴定中，共鉴定出3 株洛非不动杆菌、5 株Towneri 不动杆菌、1 株琼氏不动杆菌。

3 猪源不动杆菌的致病性机制研究

3.1 猪源不动杆菌的致病因子和毒力机制研究

研究猪源不动杆菌的致病因子和毒力机制对于预防和控制该病菌的传播具有重要意义。首先，猪源不动杆菌的致病因子包括外毒素和内毒素。其中最重要的外毒素是猪源不动杆菌外毒素1（ApxI）、猪源不动杆菌外毒素2（ApxII）和猪源不动杆菌外毒素3（ApxIII）。这些外毒素可以通过破坏宿主细胞膜的完整性，引起组织坏死、细胞溶解和炎症反应，从而造成感染猪源不动杆菌的严重症状。其次，猪源不动杆菌的毒力机制主要包括菌体附着、菌体入侵和菌体生长。猪源不动杆菌通过其表面结构与宿主细胞的表面结构进行特异性结合，能够实现菌体的附着，进而入侵宿主细胞。在菌体入侵过程中，猪源不动杆菌可以利用一些细菌的分泌系统和表面分子将毒力因子注入宿主细胞内部。这些毒力因子产生的外毒素会破坏宿主细胞的膜结构，导致细胞溶解和坏死。

为了研究猪源不动杆菌的致病因子和毒力机制，可以通过蛋白质分离和鉴定技术来确定猪源不动杆菌所产生的外毒素和内毒素的类型及功能；可以使用免疫组织化学或免疫荧光染色技术来观察猪源不动杆菌与宿主细胞之间的相互作用和内毒素的分布情况；可以利用细胞培养和小鼠感染模型，来评估猪源不动杆菌的致病性与毒力；还可以通过基因敲除或突变技术，来研究猪源不动杆菌致病因子和毒力机制中重要的基因与蛋白质。

3.2 菌株间遗传变异和基因调控对致病性的影响

猪源不动杆菌是一种具有重要致病性的病原菌，其致病性机制涉及菌株间遗传变异和基因调控的复杂网络。研究菌株间遗传变异和基因调控对猪源不动杆菌的致病性有利于深入了解该菌株的致病机制。首先，菌株间遗传变异对于猪源不动杆菌的致病性具有显著影响。不同菌株之间存在着遗传多样性，导致其在毒力因子表达和传播方面存在显著差异。对此，相关人员可以利用分子生物学技术，如PCR 和测序等方法，比较不同菌株的基因组，找出与其致病性相关的基因差异。通过研究这些功能和调控机制的差异，可以确定菌株间遗传变异对于猪源不动杆菌的致病性影响的潜在机制。其次，基因调控也对猪源不动杆菌的致病性具有关键作用。猪源不动杆菌的基因表达受多种调控机制影响，如转录因子、非编码RNA 和环境响应等。相关人员可以通过基因组学和转录组学等方法，来识别并分析与猪源不动杆菌致病性有关的调控元件和调控因子；可以利用RNA 测序等技术，揭示猪源不动杆菌在不同环境和宿主条件下的基因表达模式与调控机制。此外，还可以通过基因敲除、基因突变和基因表达调控等技术，来验证调控因子对猪源不动杆菌致病性的影响。

3.3 对宿主免疫系统的影响和逃逸机制

猪源不动杆菌可以通过多种途径来影响和躲避宿主免疫系统的攻击，从而成功感染宿主并引发疾病。第一，免疫抑制因子。猪源不动杆菌可以产生各种用于抑制宿主免疫系统的因子，如细菌素、毒素等。这些因子能够抑制宿主免疫细胞的增殖和功能的发挥，干扰宿主的免疫应答过程，并削弱宿主免疫系统的攻击能力。第二，细菌致病因子。猪源不动杆菌能够通过产生多种致病因子来干扰宿主免疫系统的正常功能。例如，菌株中的一些蛋白质能够干扰宿主免疫细胞的信号转导通路，从而抑制免疫细胞的活化和免疫应答。第三，对抗黏液和免疫球蛋白。猪源不动杆菌表面的多糖结构和蛋白质能够与宿主分泌的黏液和免疫球蛋白相结合，形成膜上免疫防御屏障，抵挡免疫细胞的接触和攻击。第四，菌株间的遗传变异和基因调控。不同菌株之间存在遗传变异，这些变异可能会影响到猪源不动杆菌的致病性及其对宿主免疫系统的逃逸能力。相关人员需要通过对比不同菌株的基因组和基因表达模式来探索这些差异，并揭示菌株遗传变异和基因调控对于猪源不动杆菌致病性机制的影响。

4 结语

猪源不动杆菌是一种感染猪类的主要致病菌，可以引起布鲁氏菌病。布鲁氏菌病是一种广泛分布于世界范围内的人兽共患传染病，对养殖业和公共卫生造成了重大威胁。研究猪源不动杆菌的分子生物学特征及其致病性对于布鲁氏菌病的防控、人畜健康以及分子鉴定技术的推广具有重要意义。本文主要采用PCR 检测技术对猪源不动杆菌进行分子生物学鉴定并研究其致病性和致病机制，希望可以为公共卫生防控工作提供参考。