碱蓬多糖长循环脂质体的制备

刘欣鑫，姚必君，刘昱宏，邵端阳，韩冠英

(1.锦州医科大学附属第一医院；2.锦州医科大学附属第三医院，辽宁 锦州 121000)

碱蓬(Suaedasalsa，SS)为一年生草本植物。具有降血脂、清热消积、提高免疫力和抗肿瘤等功效[1]。植物多糖是近几年来研究的热点，是一类具有多种生物活性和功能的大分子物质[2-4]。碱蓬多糖(Suaedasalsapolysaccharide，SSP)是从碱蓬中提取的主要活性成分，刘欣鑫等采用水提醇沉的方法优化了碱蓬多糖的提取工艺[5]，得到了成分均一的碱蓬多糖并验证了其抗肿瘤活性。然而，纯度高的多糖得率较低，多糖的结构特点和理化性质导致多糖代谢较快，难以在血浆中长时间滞留，而多糖脂质体制剂的开发不仅能提高其稳定性，还可提高其生物利用度[6]。

新型脂质体有很多种类型，而长循环脂质体(long-curculating liposome，LCL)为其中一种，这种类脂衍生物的新型脂质体的表面均通过天然或合成聚合物修饰[7]，其中研究较为广泛和深入的是聚乙二醇修饰聚合物[8]。衍生化磷脂由聚乙二醇分子与磷脂分子通过共价键结合所形成，其能够有效保护脂质体，通过阻止血液中不同组分对脂质体的结合[9]，使脂质体的识别和摄取显著降低，延长了体循环时间，提高了半衰期；同时更容易通过肿瘤新生血管间隙渗漏到肿瘤组织中，使肿瘤部位的药物摄取率得到提高[10]。因此，本研究将SSP制备成长循环脂质体(SSP-LCL)，改善药物在体内的吸收，达到长效缓释的效果，为研发新型抗肿瘤药物提高一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

碱蓬(辽宁省锦州市沿海滩涂湿地；经锦州医科大学附属第一医院韩冠英教授鉴定为碱蓬属碱蓬草)；大豆磷脂(上海太伟药业有限公司)；胆固醇(上海科技医药有限公司)；PEG2000-DSPE(上海麦克林生化科技有限公司)；其余均为分析纯。

电子天平(上海元析仪器有限公司)；旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；溶出仪(上海申安医疗器械)；透析袋(Sigma公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；高速离心机(江苏金城国胜实验仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 碱蓬多糖的制备

取碱蓬的干燥叶粉碎后，过20目筛。称取碱蓬粗粉以80%乙醇回流脱脂，每次2 h。提取完毕，过滤，残渣置于烘箱内烘干。残渣加10倍量水于80 ℃水浴锅中加热回流提取，每次3 h。浸提后抽滤，3000 r/min离心15 min，取上清液浓缩，按Sevag法脱蛋白后，加3倍量的90%乙醇过夜沉淀，离心，冷冻干燥，即得碱蓬粗多糖。称取0.5 g样品碱蓬粗多糖分别加载到DEAE-52纤维素阴离子交换柱(2.6 cm×30 cm)和Sephadex G-75凝胶柱上，进行梯度洗脱，每5 mL收集一管，合并单一峰位收集，冷冻干燥得均一碱蓬多糖SSP[5]。通过高效凝胶渗透色谱法测定，色谱柱为TSK-gel G3000PWxl(7.5 mm×300 mm)凝胶色谱柱，流动相为0.05 M NaCl，流速为0.5 mL/min，进样量20 μL，得到分子量为53.8 kDa的均一多糖。

1.2.2 碱蓬多糖长循环脂质体的制备工艺

称取适量的大豆磷脂、胆固醇、PEG2000-DSPE，均置入250 mL旋蒸瓶中，加20 mL三氯甲烷使其溶解，减压除有机溶剂(50 ℃，60 r/min)，旋蒸至溶液在瓶壁上形成透明均匀薄膜。同时，称取2 mg SSP，加入pH=6.4磷酸盐缓冲液使其溶解，与上述旋蒸瓶中溶液混合均匀，搅拌水化，水溶超声20 min，即得SSP-LCL混悬液初品。通过0.1 μm脂质体挤出器将SSP-LCL混悬液挤出数次，得到带乳光的SSP-LCL浓溶液混悬液，调整体积，0.22 μm PVDF膜过滤除菌，充氮、灌封，即得SSP-LCL。

1.2.3 包封率的测定

称取10 mg SSP，加水溶解转移容量瓶中，定容至100 mL，震荡均匀，将浓度为100 mg/L的SSP溶液作为对照品储备液。吸取上述溶液，加流动相分别稀释成浓度为0、8、20、50、80、100 μg/mL的SSP对照品溶液，将数据进行线性回归分析，以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，苯酚-硫酸法制作多糖含量测定标准曲线得标准曲线方程为A=210.58C+82.37(r=0.9998)。

采用低温超速离心法测定包封率。精密吸取SSP-LCL 1 mL于离心管中，将其放置在高速离心机中离心90 min，转速为20 000 r/min，确保脂质体与游离药物分离，吸取上清液到容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，作为W游离；同时量取1 mL SSP-LCL至50 mL容量瓶中进行破乳，试剂为2 mL乙醇/氯仿(2∶1)的混合溶液，甲醇定容作为W总，分别测定，计算包封率(EE%)：EE%=(W总-W游离)/W总×100%。

1.2.4 单因素实验

采用1.2.1项下方法制备SSP-LCL，处方筛选条件为：固定处方条件为PEG2000-DSPE浓度0.5 mg/mL、磷脂与药物的质量比30∶1、磷脂与胆固醇的质量比10∶1、考察不同磷脂浓度(10、20、30、40、50、60 mg/mL)对SSP-LCL包封率的影响；固定处方条件为磷脂浓度20 mg/mL、磷脂与药物的质量比30∶1、磷脂与胆固醇的质量比10∶1、考察不同PEG2000-DSPE浓度(0.1、0.25、0.5、0.7、0.9、1.0 mg/mL)对SSP-LCL包封率的影响；固定处方条件为磷脂浓度20 mg/mL、PEG2000-DSPE浓度0.5 mg/mL、磷脂与胆固醇的质量比10∶1、考察不同磷脂与药物的质量比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1)对SSP-LCL包封率的影响；固定处方条件为磷脂浓度20 mg/mL、PEG2000-DSPE浓度0.5 mg/mL、磷脂与药物的质量比30∶1、考察不同磷脂与胆固醇的质量比(3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)对SSP-LCL包封率的影响；进行单因素实验，考察各因素变量对SSP-LCL包封率的影响。

1.2.5 Box-Benhnken中心组合实验设计

使用单因素试验初步揭示规律，各因素再选取对SSP-LCL包封率影响最大3个的水平，使用Box-Benhnken分析方法建立一个4因素3水平的中心组合实验，响应值为SSP-LCL的包封率，使用-1、0、1对试验中各因素的3个水平进行编码，见表1。

表1 响应曲面设计实验因素水平和编码

1.2.6 碱蓬多糖长循环脂质体体外释放考察

在SSP-LCL体外释放考察过程中，释放介质选取pH=6.8的PBS溶液。称取步骤1.2.2中0.5 g SSP-LCL，加2 mL水使其溶解，将样品转移到透析袋中，同时加入20 mL释放介质，在37 ℃恒温条件下进行透析，转速为100 r/min，在相应的时间点取适量的释放介质，同时添加与其体积、温度均相同的新鲜释放介质。采用HPLC测定释放介质中SSP-LCL浓度。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 单因素实验

2.1.1 磷脂浓度对包封率的影响

脂质体的包封率变化与磷脂浓度相关。包封药物的能力在低磷脂浓度条件下较弱，而浓度太高会发生聚集并导致稳定性下降[11]，当磷脂浓度30 mg/mL时，包封率明显减小。以上结果提示包封率受磷脂浓度影响，继续将其作为响应面法优化处方工艺的考察因素，磷脂浓度为30 mg/mL是比较合适的处方条件，见图1。

图1 磷脂浓度对包封率的影响

2.1.2 PEG2000-DSPE浓度对包封率的影响

包封率变化与PEG2000-DSPE浓度变化相关，呈现出PEG2000-DSPE浓度由低到高的过程中二者共同增加，到一定PEG2000-DSPE浓度后包封率会随之降低。该现象原因考虑为过高的PEG2000-DSPE浓度占据脂质双层膜空间，影响包封率的减小。因此，PEG2000-DSPE浓度为0.7 mg/mL为较合适的处方工艺，见图2。

图2 PEG2000-DSPE浓度对包封率的影响

2.1.3 磷脂与药物的质量比对包封率的影响

包封率与脂药比之间呈现出正相关的趋势，且脂药比为20∶1时，包封率的值呈稳定趋势。包封率的值受磷脂与药物比例的严重影响，磷脂对药物的承载能力也同样有限，所以当碱蓬多糖的投药量过大时，脂质囊材没有足够的空间对大量的药物进行包封，引起包封率明显降低，甚至可能出现药物析出的情况；若投药量过小，则包封率高，载药量小。由此可见，合适的处方条件为脂药比20∶1，见图3。

图3 磷脂/药物对包封率的影响

2.1.4 磷脂与胆固醇的质量比对包封率的影响

随着胆固醇比例的降低，包封率的值表现为先增大后减小，当膜材比为15∶1时，包封率达到最大值。究其原因，可能是胆固醇具有调节磷脂流动性的特性，起到稳定脂质双分子膜的作用，但当胆固醇所占比例太大时，其在脂质双层膜中也占据相当的空间，这时的胆固醇则出现干扰脂质囊泡形成的行为，表现为包封率降低[12]。综上所述，脂质体的载药量和脂质体的稳定性都与膜材比密切相关，见图4。

图4 磷脂/胆固醇对包封率的影响

2.2 BBD实验结果及数据分析

2.2.1 BBD实验设计方案及结果

依据单因素实验结果，Design-Expert8.0.6统计分析软件给出的实验方案及结果见表2，以SSP-LCL的包封率为响应值，以磷脂浓度(A)、PEG2000-DSPE浓度(B)、磷脂与药物的质量比(C)、磷脂与胆固醇的质量比(D)为自变量，建立4因素3水平中心组合实验设计，可得到29个实验方案用以计算实验误差。

表2 响应面实验分析方案及结果

2.2.2 回归方程拟合及方差分析

通过Design Expert 8.0.6统计软件，对各因素进行回归方程拟合并对数据进行回归分析，得到回归方程：Y=+85.62+4.59A+9.17B+3.23C+3.54D+5.03AB+0.52AC+0.58AD-2.60BC+1.60BD+1.15CD-7.93A2-9.5B2-5.13C2-5.68D2；回归模型的R2=0.9787，RAdj2=0.9574，由方差分析可知回归方程模型差异有统计学意义(P<0.0001)，证明该方法可行性高，模型与实际拟合良好，失拟项差异无统计学意义(P>0.05)，回归方程可以代替实验真实点，并以此为依据对实验结果进行分析。结果见表3，磷脂浓度(A)、PEG2000-DSPE浓度(B)、磷脂与药物的质量比(C)、磷脂与胆固醇的质量比(D)、磷脂浓度与PEG2000-DSPE浓度交互项(AB)、PEG2000-DSPE浓度与磷脂与药物的质量比交互项(BC)、磷脂浓度二次项(A2)、PEG2000-DSPE浓度二次项(B2)、磷脂与药物的质量比二次项(C2)、磷脂与胆固醇的质量比二次项(D2)对响应值影响显著。

表3 回归模型及方差分析

2.2.3 响应面图分析

当存在多因素影响实验条件时，可使用响应面法优化结果，通过固定的实验次数可以对试验因素进行连续分析，并生成直观的3D曲面图用于进一步评价各因素间的交互作用[13-14]。通过软件Design-Expert得到响应值的3D曲面，可进一步分析各因素对SSP-LCL包封率的影响及各因素间的交互作用。由图5可知，磷脂浓度、PEG2000-DSPE浓度、脂药比和膜材比4个因素中，当两个因素为零水平时，另外两个因素间的交互作用对包封率均有一定程度的影响。包封率随其中两个因素的增加而提高，上升到某一程度时，曲面略呈现下降或平缓趋势，结果见图5。其中图5a和图5d曲面陡峭，说明磷脂浓度和PEG2000-DSPE浓度、PEG2000-DSPE浓度和脂药比之间交互作用较明显，与方差分析结果相符。

a

固定脂药比、膜材比为零水平，磷脂浓度和PEG2000-DSPE浓度对包封率的影响和两者之间的交互作用。随磷脂浓度增加，包封率呈现先上升后平缓下降的趋势；磷脂浓度较高时，随温度增加，包封率呈现先上升再趋于平缓的趋势；在固定PEG2000-DSPE浓度条件下，随磷脂浓度增加，包封率呈现先上升后平缓下降的趋势。分析响应面图结果可见，与磷脂浓度相比，PEG2000-DSPE浓度上升的幅度更陡峭，提示包封率受PEG2000-DSPE浓度影响大于磷脂浓度，见图5a。固定磷脂浓度和膜材比为零水平，脂药比和PEG2000-DSPE浓度对包封率的影响和两者之间的相互影响程度。随脂药比和PEG2000-DSPE浓度的增加，包封率呈先上升后平缓下降的趋势，PEG2000-DSPE浓度的上升幅度显著大于脂药比的上升幅度，提示包封率受PEG2000-DSPE浓度影响更大，见图5d。

2.2.4 验证实验

通过求解回归方程，得到最优化的处方条件为磷脂浓度为32.72 mg/mL、PEG2000-DSPE浓度为0.69 mg/mL、磷脂与药物的质量比为20.32∶1、磷脂与胆固醇的质量比为17.70∶1，最大包封率达到89.87%，为方便实际操作将实验条件定为磷脂浓度33 mg/mL、PEG2000-DSPE浓度0.7 mg/mL、磷脂与药物的质量比20∶1、磷脂与胆固醇的质量比为18∶1。在处方优化后的条件下进行重复实验3次，所得平均包封率为88.25%。结果表明，实际值与回归方程拟合出的理论值匹配程度相似，表明响应面法可以有效的优化SSP-LCL的处方工艺。

2.2.5 碱蓬多糖与碱蓬多糖长循环脂质体体外释放测定结果

SSP-LCL释放缓慢，在9 h时仅释放80.2%，可能是由于脂质双分子层中的胆固醇对磷脂膜起到了稳定作用，可减缓药物从膜内到膜外的释放，说明SSP制备成长循环脂质体后具有一定的缓释效应，见图6。

图6 SSP-LCL体外释放曲线

3 讨 论

植物多糖是一种天然高分子聚合物，具有广泛的生物活性，但由于其结构特点，应用上受到了一些限制。随着多糖纳米技术的研究与发展，我们可以进一步改善药物的稳定性，并延长药物在体内的作用时间。相比于普通脂质体而言，聚乙二醇修饰的长循环脂质体的物理、化学和生物稳定性均显著提高，不仅减少了渗漏、聚集和融合，再分散性也明显增加。近年来，聚乙二醇长循环脂质体在其领域的应用研究中取得了进展，此类脂质体可包载的药物种类繁多，并在相关研究论文及专利申请中占有很大比例[15-16]。

本实验采用Box-Behnken效应面法对SSP-LCL的处方工艺进行优化，建立了包封率的回归模型，通过优化选取合适的处方条件为：磷脂浓度33 mg/mL、PEG2000-DSPE浓度0.7 mg/mL、磷脂与药物的质量比20∶1、磷脂与胆固醇的质量比为18∶1。SSP-LCL的平均包封率为88.25%，该数据的值贴近模型预测的结果，可证明该模型具有一定的可靠性。通过体外透析实验考察SSP-LCL的体外释放度，并与SSP进行比较，说明SSP-LCL具有缓释效应。