药效学结合网络药理学研究酸枣仁汤对不同疾病模型的干预作用及其作用机制＊

张洪雄，高太祥，赵 峰，王 楠，王 瑞

（山西中医药大学中药与食品工程学院 晋中 030619）

失眠是一个常见的公共卫生问题，长期失眠会使人们的健康和生活受到严重的影响，也会带来许多疾病风险，如慢性心力衰竭、心血管疾病、抑郁症和高血压等[1]。抑郁症是一种情绪障碍，其特征是持续的悲伤，无法体验快乐，并伴随着日常功能的缺陷[2]。抑郁症的发病率在全球范围内稳步上升，目前的流行病学数据显示，抑郁症现在是全球疾病负担的第三大因素[3]。

失眠和抑郁的相关治疗多以西药为主但是具有不良反应多、易复发等缺点[4]。失眠、抑郁症等精神类疾病采用中医药治疗效果明显并且对人体的副作用小，具有良好的应用前景。酸枣仁汤出自《金匮要略》，由酸枣仁、茯苓、川芎、知母、甘草组成，具有养心安神、清热除烦的作用[5]，上述5 种药物均为药食同源目录（2021 年版）所收载品种。研究显示，5-HT、NE、DA 等单胺类神经递质在失眠、抑郁症中扮演着重要的角色。5-HT 属于抑制性神经递质，可以抑制觉醒，使非快动眼睡眠延长[6]。5-HT、NE、DA 的含量减少[7]或受体功能下调[8]可能会导致抑郁症的发生。

近年来，网络药理学在中药复方研究中的应用颇有成效，与西药针对单靶点的作用机制相比，中药复方作用于多个通路和靶点，通过协同作用治疗疾病。网络药理学可以筛选出药物活性成分和疾病的相关靶点，准确预测药物的作用靶点，开发其潜在的药理作用，这与中药方剂“多成分、多靶点”的特点相一致[9]。目前，对酸枣仁汤的药理作用研究，主要围绕改善失眠的作用机制研究[10]，以及其他包括改善记忆力和抗抑郁等方面的研究[11]，但针对失眠和抑郁这两种不同疾病，如何合理应用酸枣仁汤进行治疗未见相关文献涉及。本课题组前期研究发现[12]，酸枣仁汤给药剂量不同，对脑组织中神经递质的调节存在差别。因此，本研究通过给予不同剂量SZRD 及相关阳性药，比较失眠、抑郁模型小鼠脑组织中5-HT、NE、DA 的含量变化，并进行行为学测试，明确酸枣仁汤促进睡眠、抗抑郁的作用，同时借助网络药理学预测其核心靶点和相关作用通路，探究不同剂量SZRD 对失眠、抑郁模型小鼠的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

本研究所用动物为四周龄SPF 级雄性ICR 小鼠，均购自维通利华实验动物技术有限公司，共160只，体质量为23-27 g，生产许可证编号为SCXK（京）2016-0006。在山西中医药大学动物房饲养，温度23-26℃，自由饮食、进水。动物实验经山西中医药大学医学伦理委员会批准（批准编号：2019LL155）。

1.2 仪器

旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，SY-5000）；电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司，JM-B10001）；万能高速粉碎机（浙江红景天工贸有限公司，DE-100 g）；循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司，HC-2518）；数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司，HH-2S）；大小鼠开场活动实验系统（成都泰盟软件有限公司，OFT-100）

1.3 试剂

氯化钠注射液（石家庄四药有限公司，2103041902）；蔗糖（天津市光复科技发展有限公司，20210419）；地西泮片（山东信谊制药有限公司，201001）；逍遥丸（河南省济源市济世药业有限公司，1906066）；DL-4-氯苯基丙氨酸（上海麦克林生化科技有限公司，C12072894）；戊巴比妥钠（山东西亚化学股份有限公司，F0749）；羧甲基纤维素钠（天津市科密欧化学试剂有限公司，20150110）；NE、DA、5-HT 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，202112）。

1.4 药材

（炒）酸枣仁（批号：200801）、川芎（批号：190901）、甘草（批号：200401）、茯苓（批号：210203）、知母（批号：190601）。以上5 味药材均购自山西元和堂中药有限公司，经山西中医药大学裴香萍教授鉴定均为正品。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

酸枣仁汤中各药配比依据《金匮要略》，即酸枣仁（炒）、茯苓、知母、川芎和甘草15∶6∶6∶6∶3，浸泡30 min 后，加9 倍量水回流提取3 次，每次1.5 h，将所得药液纱布过滤后浓缩至0.37 g·mL-1、3.70 g·mL-1的低、高浓度SZRD 药液。取地西泮（2.5 mg/片）2 片，加蒸馏水溶解得质量浓度为0.10 g·mL-1的地西泮溶液，作为失眠模型小鼠的阳性药。将逍遥丸（0.375 g/丸）置研钵中研磨，加蒸馏水溶解得质量浓度为0.19 g·mL-1的逍遥丸溶液，作为抑郁模型小鼠的阳性药。DL-4-氯苯基丙氨酸（PCPA）按500 mg·kg-1，0.2 mL·10 g-1·BW-1计算称取用量，研至细粉末状，加入生理盐水，并添加适量羧甲基纤维素钠（CMC-Na），边加边搅拌，调节PH=7-8，即得PCPA 混悬液，用于失眠模型小鼠的制备。

2.2 模型制备

2.2.1 失眠模型的建立及分组

适应性喂养7天后，根据其体质量排序，按照随机数字表法将80 只小鼠随机分为5 组，分别为空白组、失眠模型组、SZRD 低、高剂量组以及地西泮组，每组16 只。除空白组外，其余小鼠在9∶00-10∶00 腹腔注射PCPA 混悬液，连续2 天，空白组注射弱碱性生理盐水。

2.2.2 抑郁模型的建立及分组

适应性喂养7天后，根据其体质量排序，按照随机数字表法将80 只小鼠随机分为5 组，即空白组、抑郁模型组、SZRD低、高剂量组以及逍遥丸组，每组16只。除空白组外，其余小鼠采用孤养联合慢性不可预见性温和应激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）程序刺激的方式建立抑郁症小鼠模型，CUMS 程序刺激见表1。不可同时进行禁食和禁水刺激；每天随机刺激小鼠2 次，每天9：00 准时1 次，另1 次时间随机，不连续选用同一种刺激方法，持续28天。

表1 CUMS刺激程序

2.3 失眠小鼠模型评价

2.3.1 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

第7 天末次给药60 min 后，将小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）后置于单笼中，记录其入睡时间和苏醒时间，以翻正反射消失为入睡指标，计算睡眠持续时间。

2.3.2 旷场实验

旷场实验是动物模型行为学研究的常用方法。将每只小鼠放在5×5格、25 cm×25 cm敞口并且四周封闭的黑色旷场行为测定箱中心位置上，正上方安装红外摄像机全程记录小鼠活动情况，保证实验环境安静且光强度平和。小鼠在旷场箱中央适应1 min 后，记录5 min内小鼠穿越总格数（鼠爪至少有3只在格内方可算入），中央格停留时间以及站立次数。每次实验前，用低浓度乙醇喷洒旷场箱除去小鼠气味。

2.4 抑郁小鼠模型评价

2.4.1 旷场实验

具体操作步骤与“2.3.2”相一致。

2.4.2 糖水偏好实验

实验正式开始前1天进行糖水训练，同时放置2%蔗糖水和正常饮用水，分别位于鼠笼的两侧，每隔8 h调换水瓶位置，训练48 h 后禁食禁水24 h。同时给予2%蔗糖水和正常小鼠饮用水，并在1 h 后取出水瓶。精密称量实验前后水瓶中液体消耗量，计算糖水偏好度（%）=蔗糖水消耗量（g）/[蔗糖水消耗量（g）+正常饮用水消耗量（g）]×100%。

2.4.3 强迫游泳实验

实验正式开始前1 天对每只小鼠进行游泳训练，采用高25 cm，水温25℃的圆柱形水桶，使其游泳15 min。正式实验时，采用同样的水桶，小鼠适应2 min 后，记录4 min 内被迫漂浮的时间。当小鼠在水中的挣扎动作不大于3 s，被迫在水中浮起，只有四肢有微小的动作，即可视为不动状态。

2.5 药物干预方法

给药组给药时间为28 天。依照人和小鼠转换的等效剂量因子计算剂量，SZRD 低、高剂量组按照3.7 g·kg-1·d-1、37 g·kg-1·d-1给药（相当于成人临床剂量和成人临床剂量的10 倍），地西泮、逍遥丸组按照1.0275 g·kg-1·d-1、1.8495 g·kg-1·d-1给药（相当于成人临床剂量），模型组给予等体积的生理盐水。

2.6 取材方法

第7 天末次给药后，每组随机取半数小鼠禁食不禁水24 h，脱颈处死，摘取大脑，4℃生理盐水洗净，擦干，放入无菌冻存管中，立即放入液氮冷冻，转移至-80℃冰箱保存。第28 天末次给药后，进行行为学检测并将剩余小鼠同上述方法处理。将小鼠大脑解冻，加入冷生理盐水充分研碎，制成10%的脑组织匀浆，4000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法按照ELISA 试剂盒操作程序检测NE、DA、5-HT的含量。

2.7 网络药理学预测

2.7.1 酸枣仁汤化学成分筛选及作用靶点预测

在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库中分别检索酸枣仁、川芎、知母、甘草和茯苓等5 种中药的化学成分，筛选符合口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、化合物类药性（Druglikeness，DL）≥0.18、血脑屏障透过率（Blood brain barrier，BBB）≥-0.30 和Caco-2 渗透性预测（Caco-2 permeability，Caco-2）>-0.4 的成分[13]，得到SZRD 的潜在活性成分及相关靶点。在ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM）[14]数据库中检索上述5 味中药，选取类药性等级“优”的化合物作为活性成分[15]。课题组早期研究中[12]，借助高效液相色谱法（HPLC）对SZRD 中的斯皮诺素（Spinosin）、芒果苷（Mangiferin）、知母皂苷BII（Timosaponin BII）、阿魏酸（Ferulic Acid）、甘草苷（Liquiritin）、甘草酸铵（Ammonium glycyrrhizate）和酸枣仁皂苷A（jujuboside A）进行了含量测定。此外，通过查阅中国药典和现有文献（CNKI、PubMed）补充SZRD活性成分。

将ETCM 查找到的活性成分和药典及文献补充成分导入Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）数据库，查找Canonical SMILES 结构式，在STITCH（http://stitch.embl.de/）和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中，选择“Homo sapiens”，预测其靶点，将所得靶点导入STRING（https://cn.string-db.org/）和Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库转换为基因名[16]。STITCH 和SwissTargetPrediction 数据库根据化学相似性预测靶点；STRING 数据库和Uniprot 数据库可以将复杂名称的靶标转换为简短的基因名。

2.7.2 疾病基因的确定

使用 DrugBank（https://www. drugbank. ca）[17]、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）[18]和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）[19]三个疾病相关数据库检索“Insomnia”和“Depression”，收集与失眠、抑郁症相关的疾病靶点。DrugBank 数据库是独有的生物信息学资源平台，将药物数据、药物靶标以及疾病基因相结合；DisGeNET是一个具有多种来源的有关疾病基因及变异的数据库，涵盖了人类多种疾病和特征、基因和基因组变异；在GEO 数据库中，分别选取了与失眠和抑郁症相关的基因芯片GSE40562、GSE9116进行分析。

2.7.3 酸枣仁汤治疗失眠和抑郁症核心靶点的筛选

利用综合性生物医学可视化分析平台Hiplot（https://hiplot.org）将收集到的失眠和抑郁症疾病基因分别与SZRD成分靶点求交集，得到SZRD 治疗失眠和抑郁症的重要靶点，导入STRING 数据库中，以“high confidence（0.700）”高置信度为置信度阈值，构建重要靶点的蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并借助Cytoscape v3.9.1进行拓扑分析，综合节点连接度（degree）和介数中心性（Betweenness Centrality）筛选核心靶点。

2.7.4 生物过程分析与通路富集分析

分别将酸枣仁汤治疗失眠和抑郁症的核心靶点上传至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库[20]进行GO和KEGG 富集分析。GO富集分析可以得到基因的生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、细胞定位（Cellular Component，CC）3 种相关条目。KEGG 富集分析可以预测酸枣仁汤发挥治疗作用的相关通路。

2.7.5 “成分-核心靶点-通路”网络的构建

找出成分、核心靶点以及通路的对应关系后，保存为.xlsx 文件，导入Cytoscape v3.9.1 中构建“成分-核心靶点-通路”网络，并进行拓扑分析。

2.8 数据处理

行为学测试结果采用GraphPad Prism 8.0 软件进行绘图分析，神经递质检测结果采用SPSS 26.0软件进行统计学处理，研究所得数据均用均值±标准差（±s）表示，单因素方差分析（One-way ANOVA）进行检验后，两组数据间比较采用t检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 行为学测试结果

3.1.1 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

图1 显示，失眠模型组小鼠睡眠时间明显减少（P<0.01），SZRD 低、高剂量组和地西泮组可以增加睡眠时间（P<0.05，P<0.01），并且低剂量组和高剂量组具有显著性差异（P<0.05）。

图1 各组小鼠睡眠持续时间比较

3.1.2 旷场实验

运动轨迹平面图（图2）显示，失眠模型组小鼠在旷场箱中进入中央区域的次数明显减少，但穿过总格数增加；抑郁模型组小鼠进入中央区域的次数同样减少，同时穿过总格数也减少。

图2 小鼠运动轨迹平面图

失眠模型组小鼠穿过总格数和站立次数比空白组显著增加（P<0.01），中央格停留时间显著减少（P<0.01），酸枣仁汤和地西泮可以改善模型小鼠失眠行为表现（P<0.05，P<0.01），并且低剂量组和高剂量组具有显著性差异（P<0.05，P<0.01）；抑郁模型组小鼠穿过总格数、站立次数和中央格停留时间比空白组显著减少（P<0.01），酸枣仁汤和逍遥丸可以改善模型小鼠抑郁行为表现（P<0.05，P<0.01），并且高剂量组和低剂量组具有显著性差异（P<0.05，P<0.01），见图3。

图3 各组小鼠旷场实验检测结果

3.1.3 糖水偏好实验

抑郁模型组糖水偏好度明显降低（P<0.01），SZRD 低、高剂量组和逍遥丸组明显回升（P<0.05），并且高剂量组和低剂量组具有显著性差异（P<0.01）（图4）。

图4 各组小鼠糖水偏好度比较

3.1.4 强迫游泳实验

抑郁模型组不动时间明显增加（P<0.01）；SZRD低、高剂量组和逍遥丸组可以减少不动时间（P<0.01），并且高剂量组和低剂量组具有显著性差异（P<0.05）（图5）。

图5 各组小鼠不动时间比较

3.2 神经递质检测结果

3.2.1 酸枣仁汤对失眠小鼠神经递质含量的影响

给药7天后，失眠模型组小鼠5-HT含量明显降低（P<0.01），NE、DA 含量升高（P<0.05，P<0.01）；SZRD低、高剂量组和地西泮组5-HT 含量升高（P<0.05，P<0.01），NE、DA 含量降低（P<0.05，P<0.01）。给药28 天后，失眠模型组小鼠5-HT 含量降低（P<0.01），NE、DA含量升高（P<0.01）；SZRD 低、高剂量组和地西泮组5-HT 含量升高（P<0.01），NE、DA 含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。见表2、3。

表2 SZRD对失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，7天）

表2 SZRD对失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，7天）

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

5-HT（pg·mL-1）292.70±15.00 266.74±17.63##283.16±4.94*290.70±9.27**293.82±9.53**组别空白组失眠模型组SZRD低剂量组SZRD高剂量组地西泮组NE（pg·mL-1）158.08±16.27 174.73±7.95#165.47±7.11*163.82±10.78*162.38±11.54*DA（pg·mL-1）46.89±2.84 55.00±3.78##52.03±4.44 50.30±2.68*47.96±3.96**

表3 SZRD对失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，28天）

表3 SZRD对失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，28天）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

5-HT（pg·mL-1）263.56±10.04 235.98±7.01##261.40±10.1**247.41±5.59**262.05±9.14**组别空白组失眠模型组SZRD低剂量组SZRD高剂量组地西泮组NE（pg·mL-1）137.45±6.56 157.99±6.17##142.31±5.64**150.89±4.62*140.03±4.40**DA（pg·mL-1）44.08±2.73 54.13±5.49##47.09±2.81**51.35±1.85 45.84±1.88**

3.2.2 酸枣仁汤对抑郁小鼠神经递质含量的影响

给药7 天后，抑郁模型组5-HT、DA、NE 的含量明显降低（P<0.01）。SZRD 低、高剂量组和逍遥丸组与抑郁小鼠相比5-HT、DA、NE 的含量明显回升（P<0.01）。给药28 天后，抑郁模型组5-HT、DA、NE 的含量明显降低（P<0.01）；SZRD 低、高剂量组和逍遥丸组5-HT、DA、NE 的含量升高（P<0.05，P<0.01）。见表4、5。

表4 SZRD对抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，7天）

表4 SZRD对抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，7天）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别空白组抑郁模型组SZRD低剂量组SZRD高剂量组逍遥丸组5-HT（pg·mL-1）294.70±18.81 246.16±5.00##263.16±7.16**282.26±8.65**290.74±8.35**NE（pg·mL-1）139.18±6.81 122.41±4.33##127.59±3.38*130.33±5.93**134.11±4.45**DA（pg·mL-1）49.06±1.48 42.45±1.54##44.11±1.29*46.31±0.93**48.50±2.60**

表5 SZRD对抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，28天）

表5 SZRD对抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影响（±s，n=8，28天）

注：与空白组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

组别空白组抑郁模型组SZRD低剂量组SZRD高剂量组逍遥丸组5-HT（pg·mL-1）329.47±16.62 263.01±10.82##289.19±8.73**318.45±9.66**322.34±15.16**NE（pg·mL-1）169.84±14.36 143.04±7.14##153.76±5.11**166.00±11.42**168.03±13.51**DA（pg·mL-1）60.35±2.04 47.04±1.77##49.94±1.90**55.23±2.14**58.17±2.93**

3.2.3 低、高剂量酸枣仁汤对神经递质含量的影响

从图6 可以看出，给药28 天后，低剂量SZRD 更显著地回调由失眠引起的NE、DA 以及5-HT 的含量变化（P<0.01）；高剂量SZRD 更显著地回调由抑郁症引起的NE、DA 以及5-HT 的含量变化（P<0.05，P<0.01）。并且借助MetaboAnalyst 5.0 平台（https://www.metaboanalyst.ca/）对模型组和低、高剂量SZRD 组进行可视化分析，见图7。热图显示，低、高剂量组都能在一定程度上回调神经递质的含量，但低剂量SZRD 可以更明显地回调由失眠引起的神经递质变化，高剂量回调由抑郁症引起的神经递质变化更明显。

图6 低、高剂量SZRD对神经递质含量的影响

图7 模型组、低剂量和高剂量组神经递质含量变化热图分析

3.3 网络药理学分析

3.3.1 酸枣仁汤化学成分以及作用靶点筛选

通过TCMSP和ETCM数据库的筛选，合并补充成分删去重复值后共得到SZRD中化学成分151个，见表6。将SZRD 中各药物和成分导入Cytoscape v3.9.1 中构建“药物-成分”网络，见图8。SZRD 靶点经数据库检索去除重复项后共得到238个。

表6 SZRD部分活性成分信息

3.3.2 疾病基因获取

在DrugBank 数据库中分别检索“Insomnia”和“Depression”，得到141 个失眠相关基因和123 个抑郁症相关基因。在DisGeNET 数据库中，共得到61 个失眠相关基因和1354 个抑郁症相关基因。在GEO 数据库中，选取P≤0.05的基因，并以logFC=±1为阈值，得到50个失眠显著差异表达基因和702个抑郁症差异表达基因。合并所得疾病基因，删除重复项后得到241 个失眠相关基因和2061个抑郁症相关基因。

3.3.3 核心靶点的筛选

将SZRD 成分靶点与失眠、抑郁症疾病基因求交集，见图9，分别得到54、112个重要靶点。将上述关键靶点上传至STRING 数据库，并导入Cytoscape v3.9.1中构建PPI 网络进行拓扑分析，通过Network Analsis功能分析PPI 网络拓扑指标，以节点连接度的中位数值和介数中心性≥0.01 筛选出SZRD 治疗失眠的核心靶点18个，治疗抑郁症的核心靶点34个，见表7。

图9 SZRD成分靶点与疾病基因韦恩图

表7 SZRD治疗失眠、抑郁症前10个核心靶点

3.3.4 GO功能富集分析

通过DAVID 数据库，对SZRD 治疗失眠的核心靶点进行GO 分析，结果显示19 项与生物过程（BP）有关，包括对外源性刺激的反应、突触传递、对可卡因的反应等过程；5 项与分子功能（MF）有关，体现在多巴胺神经递质受体活性、多巴胺结合、单胺跨膜转运蛋白活性等；细胞定位（CC）检索出10 个条目，包含了突触前膜、突触后膜、神经元投射等。选取前5项条目作图分析，见图10。

图10 SZRD治疗失眠核心靶点GO分析

SZRD 治疗抑郁症的核心靶点GO 分析显示，68项条目与生物过程（BP）有关，包括细胞对镉离子的反应、基因表达的正调控、细胞对活性氧的反应等过程；18项与分子功能（MF）有关，体现在MAP激酶活性、多巴胺神经递质受体活性、多巴胺结合等；细胞定位（CC）检索出12个条目，包括谷氨酸能突触、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、突触后膜等。选取前5 项条目作图分析，见图11。

图11 SZRD治疗抑郁症核心靶点GO分析

3.3.5 KEGG通路富集分析

KEGG 通路富集分析显示，SZRD 治疗失眠与12 项通路有关，其中包括cGMP-PKG 信号通路、可卡因成瘾、cAMP 信号通路、多巴胺能突触等；SZRD 治疗抑郁症的核心靶点经过分析得到116 项通路，包括脂质和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、化学致癌作用-活性氧、多巴胺能突触等。选取前10条通路进行作图分析，见图12、13。

图12 SZRD治疗失眠核心靶点KEGG通路富集分析气泡图

图13 SZRD治疗抑郁症核心靶点KEGG通路富集分析气泡图

3.3.6 “成分-核心靶点-通路”网络

在Cytoscape v3.9.1 中构建“成分-核心靶点-通路”网络，结果如图14所示。进行网络拓扑分析后，根据degree 值大小排名筛选出SZRD 发挥治疗作用的前5 个相关靶点，见表8。结果显示，SZRD 作用于CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D 发挥其治疗失眠的作用；SZRD 治疗抑郁症可能与PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B有关。

图14 “成分-核心靶点-通路”网络

表8 “成分-核心靶点-通路”网络的前5个核心靶点

4 结论

本研究通过行为学实验和神经递质含量测定表明，酸枣仁汤具有促进睡眠和抗抑郁的作用，并且这种作用与其剂量相关，低剂量治疗失眠、高剂量治疗抑郁症时可以发挥更好的疗效。借助网络药理学方法预测出酸枣仁汤可能通过cGMP-PKG 信号通路发挥其促进睡眠的作用，并且这种作用与CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D 等靶点密切相关；酸枣仁汤发挥抗抑郁作用可能与IL-17 信号通路有关，作用于PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B 等靶点。同时，药效学实验和网络药理学预测结果表明，多巴胺能突触与单胺类神经递质的变化密切相关，在失眠和抑郁症的发生以及治疗中发挥着重要的作用。

5 讨论

本研究结果表明，酸枣仁汤具有促进睡眠、抗抑郁的作用，并且这种作用与其剂量相关。首先，通过药效学实验阐明酸枣仁汤可以改善模型小鼠失眠、抑郁行为，并且失眠、抑郁模型小鼠脑组织中NE、DA 和5-HT 的含量变化并不一致，酸枣仁汤的干预作用也存在差异。其次，通过借助网络药理学方法，预测酸枣仁汤治疗失眠和抑郁症的核心靶点，分别筛选出18 和34 个核心靶点，将核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析。最后构建“成分-核心靶点-通路”网络，并进行网络拓扑分析。经过分析筛选出治疗失眠的5个核心靶点CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D以及治疗抑郁症的核心靶点PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B。

KEGG 富集分析显示，SZRD 治疗失眠与cGMPPKG 信号通路密切相关。cGMP-PKG 信号通路中的环磷酸鸟苷（Cyclic guanosine monophosphate，cGMP）可被G 蛋白偶联受体活化发挥信息传递作用，参与细胞膜离子通道的开启、糖原分解以及细胞凋亡等[27]。很多存在于脑中的神经递质，包括5-HT，多巴胺，γ-氨基丁酸和谷氨酸等，通常作用于G 蛋白偶联受体发挥作用。因此，cGMP-PKG 信号通路参与了复杂的中枢神经系统调节过程，在控制神经元兴奋性与高级神经功能中具有重要作用[28]。IL-17 信号通路与神经炎症有关，其中的白介素-17（IL-17）是一种促炎细胞因子，可以促进T 细胞的激活，介导组织炎症反应[29]。动物研究表明，反复的环境应激会导致神经递质调节失调[30]，产生抑郁样行为，导致血液和大脑中促炎症细胞因子表达增加[31]。神经炎症在抑郁症的发生中起着关键作用，抑郁症与慢性炎症性疾病具有较高的共患病率，包括心血管疾病、糖尿病和癌症等，长期的炎症过程是这些全身性疾病发病机制的关键驱动因素[32]。因此，IL-17信号通路在SZRD 治疗抑郁症的过程中发挥着重要的作用。

在SZRD 治疗失眠和抑郁症的KEGG 富集分析中，均富集出了多巴胺能突触这一条通路，表明该通路在失眠和抑郁症的治疗中发挥着重要的作用。多巴胺能突触与多巴胺的释放密切相关，多巴胺作为NE 合成的前身，调控着中枢神经系统的多种生理功能，在自主运动和学习记忆中起着重要的生理作用，并且参与多种神经疾病的发生[33]。因此，通过研究NE、DA 和5-HT 的含量变化，一定程度上验证了多巴胺能突触参与了失眠和抑郁症的发生。单胺类神经递质NE、DA 以及5-HT 参与人和动物多种精神活动的调节，是脑内重要的神经递质，众多研究认为，多种神经精神疾病的发生与脑内单胺类神经递质的水平有关[34]。本研究在前期工作基础上，认为酸枣仁汤可能通过调节脑内NE、DA 和5-HT 的含量，表现出治疗失眠、抗抑郁的作用。药效学实验和网络药理学表明，失眠、抑郁模型小鼠脑组织中NE、DA、5-HT 的含量变化并不一致，SZRD 在发挥治疗作用时存在差异，低剂量干预失眠模型小鼠，高剂量干预抑郁模型小鼠可以更好地发挥疗效。酸枣仁汤促进睡眠、抗抑郁作用与脑组织中NE、DA、5-HT 的表达有关，并且cGMP-PKG 信号通路和IL-17 信号通路可能也参与了这种作用，后续课题组将进行进一步实验研究验证。