肝郁肾虚型不明原因复发性流产临床表现与肠道菌群相关性研究＊

冯晓玲，涂许许

（1. 黑龙江中医药大学附属第一医院 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学研究生院 哈尔滨 150040）

复发性流产（Recurrent spontaneous abortion，RSA）是一种常见的不良妊娠结局，影响约5%的女性。常见的病因有解剖学、染色体及内分泌异常、感染、环境污染、自身免疫机制等，但仍有约40%-50%的RSA 病因不明，称不明原因复发性流产（Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1]。RSA 属中医“滑胎”范畴，而肝郁肾虚型又为其常见证型，除肾虚证表现外，常伴烦躁易怒、心情抑郁等症状。针对RSA 患者负性情绪的研究也发现，RSA 患者相较健康女性更易出现压力、抑郁等不良情绪[2]。近年来，随着人们对精神心理疾病发病机制研究的进展，肠道微生物与大脑通过“脑-肠-微生物”轴双向沟通的理论开始建立，肠道菌群的失调可能与URSA 的负性心理状态存在一定联系[3]，本研究通过分析未孕肝郁肾虚型URSA 患者肠道菌群特点及与临床症状的联系，为后续URSA 机制及治疗研究提供新视角。

1 对象与方法

1.1 对象

研究对象均来自于黑龙江中医药大学附属第一医院妇科门诊及住院部，收集时间为2020年9月-2021年1月。研究对象包含两组：肝郁肾虚型未孕URSA患者28 人、健康未孕女性43 人，所有受试者均签署知情同意书，本实验经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

URSA诊断标准参照相关共识[4]制定：①12孕周内自然流产次数≥2；②夫妇双方无遗传性疾病，染色体正常；③生殖道解剖结构无异常；④内分泌正常；⑤排除自身免疫异常；⑥无支原体、衣原体及病毒等感染；⑦男方精液检查正常。

1.2.2 中医诊断标准

肝郁肾虚型滑胎的中医诊断标准按照《中医妇科学》[5]、《中医病症诊断疗效标准》[6]制定。

（1）主症：屡孕屡堕、如期而堕。

（2）次症：①肝郁：胸胁、乳房、小腹胀满或疼痛，胸闷不舒，烦躁易怒，心情抑郁；②肾虚：头晕耳鸣，腰酸膝软，夜尿频，失眠健忘。

（3）舌脉：舌淡黯，苔薄黄或少苔，脉沉细弱或沉弦。

符合主症及次症中肝郁及肾虚症状各1 项及以上，结合舌脉即可诊断。

1.3 纳入标准

①育龄期妇女，年龄20-40 岁；②1 个月内未服用过抗生素、微生态制剂；③签署知情同意书；④所有组别均为汉族人群，地域无跨度差异；⑤URSA 肝郁肾虚组应同时符合西医及中医诊断标准；⑥健康对照组：有至少1次正常生育史，既往无不良孕产史。

1.4 排除标准

①患RSA有明确病因者；②合并其他疾病（如糖尿病、肿瘤、消化系统疾病、心、肝、肾、血液系统疾病及神经精神类疾病）；③入组前已服用药物治疗者；④伴有急慢性泌尿生殖系统感染者；⑤妊娠及哺乳期女性。

1.5 脱落标准

①患者自行退出；②研究者令其退出（依从性差、严重不良事件等）。

1.6 剔除标准

①收集数据不完整者；②粪便标本质检不合格者。

2 研究方法

2.1 收集资料

①收集两组受试者一般情况（姓名、年龄、身高、体重、民族、居住地）及孕产史、有无既往疾病、近3 个月饮食及服药情况。②中医证候积分采用中医证候分级量化表进行记录和评价，证候包括：胸胁、乳房、小腹胀满或疼痛，胸闷不舒，烦躁易怒，心情抑郁，头晕耳鸣，腰酸膝软，夜尿频，失眠健忘。按照无、轻、中、重分别计为0，1，2，3 分。③应用抑郁-焦虑-压力量表（Depression Anxiety Stress Scales，DASS）简体中文版量表评估URSA患者焦虑、抑郁、压力情绪，共有42个选项，患者对每一项进行自评，打分等级从0分至3分，程度依次加重[7]。

2.2 样本采集

收集两组患者粪便样本，取样时间为6∶00-10∶00，将粪便排入采集盒或清洁的容器中，用无菌棉签刮去表层粪便，用无菌采样管中的取样匙取清洁中段便约5 g，立即放入采样管中并注明标本信息，于-80℃冰箱中储存。

2.3 DNA提取与检测

总DNA 的提取用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit 试剂盒进行，DNA 提取质量使用琼脂糖凝胶电泳检测，DNA定量用紫外分光光度计完成。

2.4 PCR扩增

使用引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），扩增V3-V4 区间序列，PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳确证。在DNA提取全过程中，阴性对照采用超纯水以排除PCR结果假阳性的可能。

2.5 PCR纯化、定量及测序

PCR 产物由AMPure XT beads 纯化，Qubit 定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量评估分别采用Agilent2100生物分析仪和Illumina 的文库定量试剂盒完成。排序在NovaSeq PE250平台进行。

2.6 数据处理

样品在Illumina NovaSeq 平台上按照制造商的建议进行测序。根据fqtrim（v0.94）进行质量过滤，使用Vsearch 软件（v2.3.4）对嵌合序列进行过滤。利用DADA2进行解调，得到特征表和特征序列。多样性通过归一化到相同的随机序列计算。

2.7 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件，应用独立样本T检验，分析两组年龄差异。Alpha 及Beta 多样性用QIIME2 计算。采用Blast 进行序列比对，SILVA 数据库对特征序列进行注释。应用Spearman分析丰度前30的菌群与年龄、流产次数及临床指标间关系。采用R 包（v3.5.2）实现图形的绘制。

3 结果

3.1 年龄分布

肝郁肾虚组平均年龄32.71±3.15岁，正常组平均年龄31.51±2.73岁，两组年龄间无统计学差异（见表1）。

表1 肝郁肾虚组与正常对照组年龄对比

3.2 Alpha及Beta多样性分析

Alpha 多样性体现了一个生态环境中生物的类群数量（丰富度）及相对丰富程度（均匀性），通过分析肝郁肾虚组与对照组Alpha 多样性结果，两组在各指数均未观察到显著差异（P≥0.05，见图1）

图1 Alpha多样性分析的小提琴图

Beta 多样性指数用于比较不同群落中生物群落的多样性水平，通过分析多样性距离关系和生物群落之间分化程度，可以较好反映两个组样本间物种差异，PCoA中，未加权UniFrac距离强调了由于群落组成差异而导致的样本间的差异，而加权UniFrac 距离则更强调了不同群落物种丰度梯度的变化，结果表明两组菌群存在显著性差异（P<0.05，见图2）。

图2 Beta多样性分析的PCoA图

3.3 物种分析

柱状图显示了门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）在两组中占比最大，肝郁肾虚组中拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）占比依次位于2、3、4 位，与健康对照组中放线菌门多于拟杆菌门的表现不同（图3A）。属水平上，肝郁肾虚组含量前5的菌依次为：普氏粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、巨单胞菌属（Megamonas）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella_9），而对照组为：Bifidobacterium、Faecalibacterium、Bacteroides、Megamonas、Agathobacter（图3B）。

图3 物种分析示意图

对相对丰度最高的30 个样本数据聚类后排序生成热图，颜色条上的值是由相应颜色指示的两组样本在门、属水平上的相对丰度（图3C、3D）。

桑基图直观体现了两组在门、属水平上对应的物种相对丰度及比例（见图3E）。

3.4 差异分析（LDA effect size，LEfSe）

通过Kruskal-Wallis 秩和检验找到丰度差异类群，Wilcoxon 秩和检验判断得到的所有亚种是否趋于同一分类级别；LDA（线性判别分析）评估每个组分丰度对差异效果的影响大小，并绘制图形。图4A 中圆圈的大小与分类单元的丰度成正比。红色表示正常对照组，绿色为肝郁肾虚组，黄色为差异不显著，图4B中条形图展示了两组有显著差异菌属的LDA值。

图4 LEfSe分析示意图

3.5 菌群与临床指标间的联系

应用Spearman分析LEfSe分析中两组差异菌群与年龄、流产次数、中医证候评分、DASS-焦虑（Anxiety）、DASS-抑郁（Depression）、DASS-压力（Stress）、DASS-总分间的关系，红色及蓝色如图例显示代表正、负相关，颜色越深，相关性水平越高，有统计学意义的项目以星号标注，结果如图5、6、表2、3。

图5 年龄、流产次数、中医证候评分、DASS评分与GYSX组优势菌群间相关性分析热图

图6 年龄、流产次数、中医证候评分、DASS评分与正常组优势菌群间相关性分析热图

表2 与各指标有显著关联的GYSX组优势菌种

表3 与各指标有显著关联的正常组优势菌种

4 讨论

URSA 与中医理论中“滑胎”、“数堕胎”含义相同，论至妇科妊娠病，病机一定以冲任损伤为要，从妇科基本理论看，肝气郁结，疏泄功能失常，可致胞宫藏泻无度，或肝郁化火，热伤冲任，或妊娠血聚于下养胎，肝血不足，冲任经脉血虚，不能充养胞宫，抑或素性抑郁、情志过急，导致气分病变，影响冲任、胞宫功能，导致屡次堕胎。堕胎的发生损伤肾气，而滑胎患者屡孕屡堕，肾气益虚，而易因胎元不足而堕胎，形成恶性循环，病情迁延，久病伤络。加之部分患者素禀肾气虚弱，天癸不能充盈，胞宫本就亏虚，更易发生肾虚所致的滑胎。从肝肾的关系看，肝肾同源，肝血与肾精可互相化生滋养，但肝郁肾虚中，肝血化源不足，肾精亦不得滋养，而滑胎的反复发病，不仅加重情志异常，亦耗伤肾气，加重病情。且肝肾藏泄互用，肾精亏虚，源本不足，肝亦失于疏泄，使肾精更难化生天癸而济于冲任以养胞系胞。

对两组各105例社会人口状况相似的健康女性及RSA 患者的研究发现，RSA 女性的焦虑、抑郁程度明显更高[8]，另一项访谈则显示了RSA 患者及其伴侣的压力和疲劳随流产次数的增加而加重[9]。压力、抑郁和焦虑是高度共病的状态，具有重叠的生物学机制和表现，都被归类为应变稳态（Allostasis）失衡，通过肠道微生物群-大脑轴与肠道微生物相互作用[10]。

微生物群的失调不仅影响宿主肠道内环境的免疫，还可导致粘膜或全身免疫紊乱，而导致慢性炎症[11]，而以辅助性T细胞（Helper T cell，Th）17及Th1占优势的免疫炎性状态是URSA免疫异常的重要机制[12-13]。高脂饮食诱导小鼠含脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的肠道微生物群比例增加，LPS 是炎症的诱发因子，LPS 与其受体白细胞分化抗原（Cluster of differentiation，CD）14形成复合物，并被免疫细胞表面Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）4 识别，诱导机体发生非特异性慢性低度炎症[14]。肠道菌群还可增加肠黏膜通透性，升高LPS水平，导致炎症因子大量生成[15]。

在本研究中，Alpha 多样性未观察到显著差异，但Beta 多样性存在差异，因相较于Beta 多样性，Alpha 多样性更多的是反映群体内部的分布情况，而不是群体物种间的差异，故此结果可说明未孕肝郁肾虚型URSA患者肠道菌群与健康未孕女性不同。

具体而言，肝郁肾虚患者门水平上拟杆菌门（Bacteroidetes）及变形菌门（Proteobacteria）显著高于正常组，而放线菌门（Actinobacteria）水平则较正常组低。拟杆菌产生大量的LPS，抑制拟杆菌等产生LPS的细菌的生长可以保护肠道屏障功能，降低宿主炎症水平[16]。变形杆菌具有致病代表性，如肠杆菌属，可在特定环境中引起感染和疾病[17]。放线菌门则主要包含有益菌——双歧杆菌，其正面效应包括维持肠道屏障内稳态、促进糖类代谢、促进免疫系统发育并调节免疫反应等[18]。

LefSe 分析提示，URSA 中拟杆菌门-普雷沃菌属（Prevotella_2）为标志性物种，有研究发现普氏菌丰度的增加与炎症疾病有关，一些菌株表现出致病特性[19]，且普雷沃菌诱导小鼠结肠中Th17细胞的产生[20]。而放线菌门-双歧杆菌属（Bifidobacterium）为正常组中优势菌，双歧杆菌的减少与肠道通透性的增强有关，从而导致LPS转运到血清中，触发免疫系统激活并维持慢性炎症[21]。本研究分析了两组差异菌群与年龄、流产次数、DASS评分、中医证候评分间的联系。在正常组与中医证候评分呈负相关的菌群中，双歧杆菌数量的下降可使肠道通透性增强，LPS触发免疫反应导致慢性炎症[21]，其余菌属目前未发现与URSA发病机制相关的联系。

综上所述，本研究发现未孕肝郁肾虚型URSA 患者与正常健康女性肠道菌群构成存在差异，且患者中医证候评分与肠道菌群存在联系。后期将扩大样本量，并针对其他证型及中医药改善肠道菌群与治疗URSA间进行进一步研究。