基于HMGB1/TLR4/NF-κB通路探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫功能的影响＊

杨玉萍，段永强，梁建庆＊＊，白 敏，冯 鑫，曹力仁，虎峻瑞，范红丽

（1. 甘肃中医药大学基础医学院 兰州 730000；2. 甘肃省实验动物行业技术中心 兰州 730000；3. 宁夏医科大学中医学院 银川 750004）

原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率高居国内恶性肿瘤第二位[1-3]，中国占全球发病率的48.4%以上[4]。其作为最常见的消化道恶性肿瘤，早期起病隐匿，发现时已处于晚期，西医常规治疗首选手术及放化疗，但由于确诊时患者肝癌已处于晚期，常规治疗对患者的伤害较大，且复发率和转移率高[5]，其中对不能进行肝移植患者，只能用靶向药物（索拉非尼和伦伐替尼）给肝癌患者进行治疗，但仅能延长患者生存期2-3个月[6]，并且对全身各个系统都产生不同程度的损伤，其中对免疫系统的影响最为显著[7]，极大地降低了患者的生活质量，而中医药有明显的减毒增效特性，能够提高患者生活质量，增强机体免疫力，减轻手术、放化疗等不良反应，同时延长患者生存时间以及提高生存率[6,8]，因此在治疗肿瘤免疫抑制方面有着独特的优势和不可或缺的地位。

《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治第二十》篇中载：“妊娠，小便难，饮食如故，当归贝母苦参丸主之”。吴红彦教授结合临床精究此段文意，并在长期的疾病诊疗中，认识到肿瘤之核心病机与当归贝母苦参丸主治之证有诸多相似之处，只不过肿瘤的虚象和瘀象更加明显。故此，吴教授在当归贝母苦参丸的基础上加减化裁，创立了治疗肿瘤疾病的常用方——参芪抑瘤方。此方由黄芪、当归、贝母、苦参、山慈菇等药组成，方中重用黄芪补肺健脾，扶正益气；贝母入肝经，化痰散结，苦参清热燥湿解毒；当归补血活血，山慈菇清热化痰、软解散结，诸药相配，攻补兼施，共奏补气活血，扶正祛邪，解毒散结之功。前期课题组研究已表明参芪抑瘤方在抑制肿瘤生长、改善机体免疫力、防止肿瘤复发转移等方面具有一定的疗效[9-11]。但关于其具体的机制尚不明晰，而HMGB1/TLR4/NF-κB信号作为抑制免疫发挥作用的经典通路，在肿瘤的发病过程中具有十分重要的作用，因此，深入研究HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路在H22 肝癌荷瘤小鼠病理反应中的作用机制，并应用参芪抑瘤方进行干预，这有助于从新的角度认识肝癌的发病本质，并为采取积极的治疗措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、细胞及药物

SPF级雄性KM 小鼠，由甘肃中医药大学SPF级动物实验中心提供，许可证号：SCXK(甘)2020-0009，伦理审查批准号：2021-205，70日龄，体重18-22 g。H22肝癌细胞株，购自武汉普诺赛生命科技有限公司（BRF1A0KT3Q）。

参芪抑瘤方所有药材均购自甘肃中医药大学附属医院，并经甘肃中医药大学中药生药学教研室李岳峰教授鉴定为正品，黄芪30 g、当归20 g、山慈菇10 g、土贝母10 g、苦参15 g、八月札30 g、莪术10 g、半枝莲20 g、白术18 g、枳壳12 g、人参15 g。所有药材按比例加水煎煮，浓缩至含生药量2.5 g·mL-1，装瓶，4℃保存备用。注射用顺铂（购自甘肃中医药大学附属医院，OKO554B03）。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：RIPA裂解液（Cat#R0010）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（Cat#PC0020）、4×蛋白质上样缓冲液（P1016），北京索莱宝科技有限公司；HMGB1（Cell Signaling Technology，6893S）、TLR4（GTX64330）、MyD88（ImmunoWay，YT2928）、NF-κB（Cell Signaling Technology，8242S）、β-actin（ImmunoWay，YM3028）、羊抗兔二抗(ImmunoWay，HRP-conjugated affinipure goat anti-rabbit IgG（H+L），RS0002)；ECL 化学发光超敏显色试剂盒（Lot NO:57105010）；FITC-CD3+（Lot:A10913）APC-CD4+（Lot:A10811）与Anti-Mouse-CD8+（Lot:A10514）单克隆抗体，联科生物；总RNA 提取试剂盒（Lot#W9414）；逆转录试剂盒（LOT：G7106010）；实时qPCR Mix（LOT：H9114010）。

仪器：电泳仪（041BR69450）、VE-180 型垂直板电泳装置（153BR111209）、酶标仪（iMark）、伯乐生命医学产品（上海）有限公司；GeLView 6000 plus 凝胶成像系统，广州博鹭腾生物科技有限公司；高端分析型流式细胞仪（FACSCelesta），美国BD 公司；实时荧光定量PCR仪（CG-05），杭州晶格科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复制H22肝癌荷瘤小鼠模型

复苏H22 肝癌细胞，细胞复苏后，将细胞浓度调至1×107·mL-1，每只KM小鼠腹腔接种0.2 mL。腹腔传至第三代，抽取淡黄色腹水，进行细胞计数后，选取上述最佳细胞浓度3×106·mL-1，每只小鼠消毒后于右侧腋窝接种细胞悬液0.1 mL，待触到黄豆大小肿块提示模型复制成功[12]，可纳入实验研究。

1.2.2 小鼠分组及干预

50 只SPF 级雄性KM 小鼠，采用随机数字表法取10 只小鼠作为空白组，（0.1 mL·10 g-1，qd，生理盐水灌胃），其40只小鼠复制H22肝癌荷瘤小鼠模型，模型复制成功后将模型小鼠随机分为模型组（0.1 mL·10 g-1，qd，生理盐水灌胃）、顺铂组（0.1 mL·10 g-1，biw，腹腔注射2.5×10-3g·kg-1）、参芪抑瘤方组（含生药2.5 g·mL-1，0.1 mL·10 g-1，qd，灌胃）以下简称中药组）、参芪抑瘤方（含生药2.5 g·mL-1，0.1 mL·10 g-1，qd，灌胃）+顺铂组（0.1 mL·10 g-1，biw，腹腔注射2.5×10-3g·kg-1）（以下简称联合组）。顺铂和参芪抑瘤方给药均按照人与动物体质量进行折算[13]，顺铂给药量为2.5×10-3g·kg-1，参芪抑瘤方给药量为27.03 g·kg-1。空白组与模型组均给予相同体积生理盐水灌胃及腹腔注射，连续干预13天，末次给药24 h 后，用戊巴比妥钠（每只0.2 mL）麻醉处死小鼠，取材待检。

1.2.3 肿瘤抑瘤率及脏器指数测定

在无菌环境下完整剥离出小鼠瘤组织和脏器组织，电子天平秤重后计算抑瘤率和脏器指数。抑瘤率(IR)=[模型组瘤质量(g)-用药组瘤治疗(g)]/模型组瘤质量(g)×100%]，脏器指数=[脏器质量(㎎)/小鼠体质量(g)][14]。

1.2.4 HE染色观察各组小鼠肿瘤组织病理学变化

肿瘤组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后用苏木精和伊红染色，封片。光镜下观察肿瘤组织形态学变化。

1.2.5 流式细胞术检测脾组织CD4+、CD8+细胞水平

摘取新鲜脾脏并用300目细胞筛网研磨，用PBS冲洗筛网，收集细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106mL，分别用CD3 偶联FITC、CD4 偶联APC、CD8 偶联PE 染色30 min，检测CD3+、CD4+、CD8+T 细胞的比例，通过测量T 细胞总数（CD3+细胞）中CD4+和CD8+淋巴细胞的百分比来计算结果。

1.2.6 Western blot检测肿瘤组织中相关蛋白表达

称取肿瘤组织，蛋白裂解液裂解，并定量变性，通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，1×TBST 洗膜，二抗（1∶20000）室温孵育1 h。用1×TBST 洗涤后，加入ECL 发光溶液并用凝胶成像仪曝光。采用Image J 8.0分析蛋白条带灰度值。

1.2.7 RT-PCR检测肿瘤组织中相关mRNA表达

称取肿瘤组织，提取RNA，超微光学分光光度计测量总RNA 浓度。根据逆转录试剂盒将总RNA 反转录成cDNA。GAPDH 为内参基因，每组相同基因设4 个重复，根据RT-PCR 扩充试剂盒说明扩增靶基因，并计算每个mRNA 的相对表达。引物由上海百赛生物技术股份有限公司公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2 数据分析

实验数据均用SPSS 24.0 软件处理，并采用均数±标准差（±s）表示，以P<0.05 表示差异有统计学意义，图片采用Image J 8.0处理。

3 结果

3.1 各组小鼠肿瘤病理学特征的变化

HE 染色显示，在模型组中，肿瘤组织细胞排列紧密，边界清晰，核大浆少，核深染，未见坏死区域（图1A）；在顺铂组肿瘤细胞排列疏松，边界模糊，细胞核出现缩小破裂现象，出现坏死细胞现象（图1B）；中药组肿瘤细胞坏死不明显（图1C）；在联合组肿瘤细胞核固缩破裂明显，且不同程度出现片状坏死区域（图1D）。用Image J 8.0 进行肿瘤细胞核数目占比分析，与模型组相比，各治疗组肿瘤细胞核数目均减少，组间差异均有统计学意义（P<0.05）；与顺铂组和中药组相比，联合组肿瘤细胞核数目减少显著（P<0.05）（见表2）。

图1 H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织学变化（HE，×400）

表2 肿瘤细胞核数目占比（±s，n=6）

表2 肿瘤细胞核数目占比（±s，n=6）

注：与模型组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05；与中药组相比，&P<0.05。

细胞核占比（%）-39.39±1.833 27.67±0.91*33.83±2.36*24.75±2.22*#&组别空白组模型组顺铂组中药组联合组

3.2 各组小鼠体质量、瘤体积及抑瘤率的变化

与模型组相比，各治疗组平均瘤质量均降低（P<0.05）见表3。与模型组相比，各治疗组小鼠瘤体积均减小，联合用药组小鼠瘤体积减小显著（P<0.05），见图2A；与模型组相比，各治疗组小鼠体质量均升高，联合用药组升高明显（P<0.05），见图2B。

图2 各组小鼠瘤体积和体质量变化

表3 各组瘤质量和抑瘤率（±s，n=10）

表3 各组瘤质量和抑瘤率（±s，n=10）

注：与模型组相比，*P<0.05。

组别空白组模型组顺铂组中药组联合组瘤质量（g）-5.30±1.16 3.01±0.88*4.11±1.31*2.44±0.93*抑瘤率（%）--43.15%22.32%53.97%

3.3 各组小鼠脾指数、胸腺指数的变化

与空白组相比，模型组小鼠脾指数、胸腺指数均降低（P<0.05）；与模型组和顺铂组相比，中药组和联合用药组小鼠脾脏指数、胸腺指数均升高（P<0.05）；与中药组相比，联合组小鼠脾脏指数、胸腺指数均降低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 各组小鼠脾指数和胸腺指数（±s，n=10）

表4 各组小鼠脾指数和胸腺指数（±s，n=10）

注：与空白组相比，￥P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05。

组别空白组模型组顺铂组中药组联合组脾指数（mg·g-1）8.59±2.02 4.00±2.69￥3.45±1.71 7.34±3.08*#6.94±2.75*#胸腺指数（mg·g-1）2.51±0.93 0.79±0.29￥0.70±0.40 2.13±0.92*#1.53±0.53*#

3.4 各组小鼠脾脾淋巴细胞亚群水平的变化

流式结果显示（图3、表5），与空白组相比，模型组小鼠脾脏组织中CD4+T细胞水平降低，CD8+T细胞水平升高（P<0.05）；与模型组和顺铂组相比，中药组和联合组小鼠脾脏组织中CD4+T细胞水平、CD4+/CD8+比值均升高，CD8+T细胞水平降低（P<0.05）；与中药组相比，联合组小鼠脾脏组织中CD4+T细胞水平、CD4+/CD8+比值降低，CD8+T 细胞水平升高（P>0.05）。结果表明，在调节机体免疫方面，单用中药略优于联合用药。

图3 各组小鼠脾淋巴细胞亚群水平变化

表5 各组小鼠脾淋巴细胞亚群水平变化（±s，n=3）

表5 各组小鼠脾淋巴细胞亚群水平变化（±s，n=3）

注：与空白组相比，￥P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05。

组别空白组模型组顺铂组中药组联合组CD4+24.73±1.00 19.13±0.38￥17.77±1.99 24.17±3.10*#21.57±1.70#CD8+18.17±1.33 25.17±2.59￥27.30±1.97 19.90±1.44#22.00±2.85*#CD4+/CD8+1.52±0.15 0.77±0.07￥0.65±0.07 1.21±0.09*#1.00±0.20*#

3.5 参芪抑瘤方联合顺铂对H22 肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κBmRNA 表达的影响

RT-PCR 结果显示（表6），与模型组相比，各治疗组瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 表达均降低（P<0.05）；与顺铂组相比，联合组瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达均降低（P<0.05）；与中药组相比，联合组瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达均降低（P<0.05）。

表6 各组小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表达变化（±s，n=4）

表6 各组小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表达变化（±s，n=4）

注：与模型组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，#P<0.05；与中药组相比，&P<0.05。

NF-κB/GAPDH 1.00±0.00 0.64±0.04*0.87±0.05*0.47±0.03*#&组别模型组顺铂组中药组联合组HMGB1/GAPDH 1.00±0.00 0.57±0.03*0.83±0.05*0.32±0.02*#&TLR4/GAPDH 1.00±0.00 0.74±0.05*0.91±0.07*0.61±0.06*#&MyD88/GAPDH 1.00±0.00 0.48±0.03*0.75±0.10*0.37±0.02*#&

3.6 参芪抑瘤方联合顺铂对H22 肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达的影响

Western Blot 结果显示（图4，表7），与模型组相比，各治疗组瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NFκB 蛋白表达均降低（P<0.05）；与顺铂组相比，联合组HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达降低（P<0.05）；与中药组相比，联合组HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白表达降低（P<0.05）。结果表明单用参芪抑瘤方或顺铂能够降低瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB 蛋白表达水平，抑制炎性反应，但联合用药组治疗效果显著。

图4 参芪抑瘤方对H22肝癌小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达影响图谱

表7 参芪抑瘤方对H22肝癌小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达影响（±s，n=3）

表7 参芪抑瘤方对H22肝癌小鼠肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达影响（±s，n=3）

注：与模型组相比，*P<0.05；与顺铂组相比，，#P<0.05；与中药组相比，&P<0.05。

组别模型组顺铂组中药组联合组HMGB1/β-actin 1.42±0.06 0.87±0.04*1.06±0.05*0.56±0.04*#&TLR4/β-actin 1.13±0.04 0.75±0.02*1.05±0.05*0.54±0.08*#&MyD88/β-actin 1.46±0.07 0.94±0.04*1.08±0.21*0.53±0.03*#&NF-κB/β-actin 1.34±0.07 0.99±0.03*1.01±0.03*0.63±0.04*#&

4 讨论

肝癌属于中医“积聚”、“肝积”等范畴。特别是近年来，随着中医药的发展和临床的广泛应用，相较于西医治疗后虽能取得一定的宏观效果，但其不良反应明显、复发率和转移率高等特点[5]，5 年生存率仅为10.1%[15]，中医药治疗能改善患者临床症状，提高生活质量，增强机体免疫力，延长患者生存时间的优势正更加突出[16]。此已被国内的诊疗指南所推荐[17]。因此，中西医结合疗法已成为临床治疗肿瘤的一种有效手段。本实验通过小鼠腹腔注射H22 肝癌细胞进行传代，传至第3 代，收集细胞，于小鼠右侧腋窝皮下种植的方法复制H22 肝癌荷瘤小鼠模型，并给与参芪抑瘤方和顺铂进行干预治疗，本研究结果显示，各治疗组小鼠的肿瘤抑制率为43.15%、22.31%、53.97%，与模型组相比，各治疗组小鼠平均瘤质量均下降，且联合组对肿瘤抑制效果显著（P<0.05），表明参芪抑瘤方联合顺铂能有效抑制肿瘤生长，且优于单用参芪抑瘤方或顺铂；实验结果表明参芪抑瘤方联合顺铂显著抑制瘤体的生长，病理检测同样证实了这一结论。

顺铂作为临床治疗肿瘤疾病的一线化疗药，能有效抑制癌细胞增殖，促进凋亡，但其选择性差，在杀死肿瘤细胞的同时，损害正常组织细胞和免疫器官，且具有免疫抑制作用[7,18]。脾脏和胸腺作为机体最大的免疫器官，主要通过淋巴细胞调节免疫功能，其脏器指数通常用于评价机体免疫状态[19]。T 淋巴细胞对于维持机体正常免疫功能至关重要[20]，其中CD4+为辅助性T 细胞，主要通过促进机体免疫系统抑制肿瘤的发生、发展，CD8+为细胞毒性T细胞，具有免疫抑制作用，CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞相互制约，共同调节机体免疫平衡[21]，其比值能够直接用于评价机体免疫状态[20,22]，本实验结果发现与空白组小鼠比较，H22 肝癌荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数、CD4+T 细胞水平以及CD4+/CD8+值显著降低、CD8+T 细胞水平升高，这与既往的研究结果一致[9-11]。而参芪抑瘤方联合顺铂给药干预后，H22 肝癌荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数、CD4+T细胞水平以及CD4+/CD8+值不同程度升高、CD8+T细胞水平降低，表明参芪抑瘤方联合顺铂显著改善了H22肝癌荷瘤小鼠机体免疫状态。

高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein，HMGB1）是一种高度保守的核蛋白，广泛存在并参与许多疾病的发展，尤其在恶性肿瘤中发挥着至关重要的作用，且参与炎症、免疫、增殖、转移和自噬等多种信号转导通路的调节[23-24]。恶性肿瘤组织中HMGB1的释放，可能与TLR4/MyD88/NF-κB 通路相关[25]，其主要作用是诱导机体免疫抑制。TOLL 样受体4（Tolllike receptor 4，TLR4）能够通过髓分化因子88（Recombinant myeloid differentiation factor 88，MyD88）激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路介导炎症反应及免疫抑制作用[26-27]，而TLR4 作为内源性HMGB1 受体[28]，能够结合HMGB1 激活NF-κB信号通路，从而促进肿瘤的发生发展[29]。本实验结果发现各治疗组能有效降低肿瘤组织中HMGB1、TLR4、MyD88 和NF-κB mRNA 和蛋白表达，且联合用药组效果显著（P<0.05），实验结果表明参芪抑瘤方联合顺铂可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路相关蛋白表达而抑制肿瘤生长。

综上所述，参芪抑瘤方联合顺铂能有效抑制肿瘤的生长，调节T淋巴细胞亚群平衡，逆转免疫抑制并增强抗肿瘤免疫应答，改善肿瘤微环境，提高机体免疫功能，其机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路活化有关。