Ezrin/YAP信号轴促进胃癌细胞增殖的作用研究

覃一晋，单汉国，陈茂良，彭肃，王春云，阳乐彬

（南华大学附属第二医院 胃肠外科，湖南 衡阳 421001）

根据全球癌症流行病学的数据[1]统计，2020年胃癌在全世界所有癌症中发病率排名第五，病死率排名第四。虽然在过去的几十年中，胃癌的发病率和病死率已经大大下降，但其总体存活率仍然很低[2]。美国胃癌患者的5年生存率为42.9%[3]，而中国仅为27.4%[4]。胃癌的发病率呈现显著的性别和地域特征[5-6]。男性的胃癌发病率为女性的两倍。东亚和东欧的发病率最高，尤其是在蒙古、日本、韩国和中国[7-8]，这可能与地区腌制食品的饮食习惯有很大关系[9-10]。对于胃癌患者来说，转移是最常见的死亡原因，也是成功治疗的主要障碍[11]。肿瘤细胞从原发部位向转移部位的扩散是一个复杂的多阶段过程，可能包括细胞增殖和迁移、基底膜降解、侵袭和黏附[12-13]。目前的临床方法不能准确预测哪些患者将发生转移。为了开发预测、诊断和治疗胃癌转移的有效新策略，必须确定控制转移的分子机制。国内外大量研究发现，埃兹蛋白（Ezrin）在胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌和乳腺癌等多种肿瘤中高表达，且与肿瘤的发生发展、侵袭转移和预后等密切相关[13-15]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被发现的成员，其基因定位于人类染色体6q25，由585 个氨基酸组成[16]。Ezrin 的一个重要功能就是构成细胞表面复合物而参与细胞-细胞间和细胞-基质间的黏附。目前，关于Ezrin 在胃癌中生长和转移的研究尚不清楚。

YAP 蛋白又称为Yes 相关蛋白，是一种细胞内连接蛋白和转录辅助激活因子，是Hippo 信号通路下游的关键转录共激活因子之一，若Hippo 信号通路失活，未被磷酸化的YAP/TAZ 则转入细胞核，与TEAD 结合，启动Mst、WW45、Lats1、Lats2 等靶基因的转录。研究表明，YAP1 蛋白在细胞核高表达预示胃癌患者预后较差[7]，课题组前期对Ezrin与YAP 在胃癌组织中的表达水平进行了初步研究，发现Ezrin 与YAP 在胃癌组织中高表达，两者表达水平正相关，且都与肿瘤的发生发展和预后密切相关。因此，在此基础上，本研究进一步在胃癌细胞中分析Ezrin 蛋白及YAP 通路的关系及其功能，为胃癌的机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞株MGC803 和AGS 均购自ATCC（美国模式菌种收集中心，USA）；常用的细胞培养试剂购自以色列Biological Industries 公司；转染试剂Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司。YAP 激动剂（HY-101299B） 购自美国MCE 公司。鼠ACTIN （货号：23660-1-AP）、YAP 抗体（货号：13584-1-AP） 购自美国Proteintech 公司；兔WW45抗体（货号：A18667）购自美国Abclona 公司；兔Ezrin （货号：AF6172）、Mst （货号：DF13152）、Lats1、Lats2（货号：DF7517）、TEAD 抗体（货号：DF3141）购自美国Affinity 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养所有细胞均用10%胎牛血清、10 μg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM 培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染细胞生长于对数生长期时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，将细胞按照每孔3×105接种在6 孔板中。常规培养18 h 后（细胞密度约为70%），按照Lipofectamine 2000 说明书进行转染，转染分组为：si-NC（转染si-NC 的阴性对照序列）、si-Ezrin（转染si-Ezrin 序列）。siRNA 由中洪分子实验室完成，分别为si-Ezrin#1：ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C；si-Ezrin#2：GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A；si-Ezrin#3：TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA。细胞转染24 h 后，收获细胞提取蛋白或者消化细胞铺板进行下一步实验。

1.2.3 qRT-PCR 检测收集样本，加入TRIzol 裂解液，提取总RNA。将RNA 通过逆转录HiFiScript cDNA 试剂盒合成 cDNA。利用荧光PCR 仪进行荧光定量PCR。反应体系如下：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL。反应步骤如下：预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40 个循环。引物由通用生物系统（安徽） 有限公司合成，Ezrin 正向：ACC AAT CAA TGT CCG AGT TAC C，反向：GCC GAT AGT CTT TAC CAC CTG A；YAP 正向：TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA，反向：TCA TGC TTA GTC CAC TGT CTG T；Mst 正向：ATC GCG TCC AGG TGC TTT C，反向：GCC CGA TAG ACC TTG CCA A；WW45 正向：ATG CTG TCC CGA AAG AAA ACC，反向：AGG CAT AAG ATT CCG AAG CAG A；Lats1 正向：AAT TTG GGA CGC ATC ATA AAG CC，反向：TCG TCG AGG ATC TTG GTA ACT C；Lats2 正向：ACT TTT CCT GCC ACG ACT TAT TC，反向：GAT GGC TGT TTT AAC CCC TCA；TEAD 正向：ATG GAA AGG ATG AGT GAC TCT GC，反向：TCC CAC ATG GTG GAT AGA TAG C；内参GAPDH 正向：GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT，反向：GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG。相对表达量根据2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 Western blot 检测用RIPA 试剂盒提取总蛋白，使用BCA protein assay kit 测定蛋白浓度。每个样品提取40 µg 上样，采用10%的SDS-PAGE 进行凝胶电泳分离，使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜转膜后用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST 溶液室温封闭后，分别滴加稀释的一抗Ezrin、YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 4 ℃过夜，添加对应的二抗室温下摇床孵育1 h。使用ECL 化学发光法使条带显影。在化学发光成像仪上进行条带曝光成像。

1.2.5 CCK-8 检测待胃癌细胞生长到对数生长期，将细胞消化下来，每孔2 000 个细胞铺于96 孔板中。第2 天去掉旧的培养基，加入100 μL 新的培养基和10 μL CCK-8，培养箱中处理3 h，用酶标仪检测OD450 处的吸光值。此数据记为第1 天的数据。剩余96 孔板中的细胞按照分组加入2.5 μmol/L的HY-101299B，继续培养2、4 d 后检测OD450 处的吸光值。

1.2.6 平板克隆实验待胃癌细胞生长到对数生长期，将细胞消化下来，每孔1 000 个细胞铺于6 孔板中。待到第2 天，去掉旧的培养基，按照分组加入2.5 μmol/L 的HY-101299B，继续培养10 d。去掉培养基，用预冷的PBS 清洗2 次，用甲醇固定15 min，PBS 清洗2 次后，用1%结晶紫染色15 min，吸去结晶紫，PBS 清洗3 次，平板晾干后拍照。用image J 统计平板克隆的数目。

1.2.7 Transwell 检测去除Transwell 小室孔中的培养基，用棉签轻轻擦去小室内的细胞，加入PBS 清洗5 min，再加入0.1 %结晶紫静置染色1 h，PBS清洗3 次，平板晾干后拍照将小室倒置在载玻片上拍照。用image J 统计细胞的数目。

1.3 统计学处理

应用 GraphPad Prism 8.0 软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ezrin沉默效果

相对于各自的空白对照组，si-Ezrin#1、si-Ezrin#2和si-Ezrin#3 转染后的MGC803 细胞中Ezrin 的mRNA水平下降约33%、28%和18%，蛋白水平分别下降约46%、37%和28%；AGS 细胞中Ezrin 的mRNA 水平下降约36%、31%和25%，蛋白水平分别下降约42%、31% 和24%；各自的阴性对照组Ezrin 的mRNA 与蛋白水平均无明显变化（均P＞0.05）（图1）。根据以上结果，选择si-Ezrin#3 进行后续实验。

2.2 Ezrin 沉默与YAP 激动剂对胃癌细胞增殖与迁移能力的影响

预实验结果显示，2.5 μmol/L 的HY-101299B 对MGC803 和AGS 细胞的激活作用最佳。CCK 结果显示；相对于阴性对照组，si-Ezrin 组胃癌细胞增殖减慢，HY-101299B 组胃癌细胞增殖加快；相对于si-Ezrin 组，si-Ezrin+HY-101299B 组胃癌细胞增殖加快（均P＜0.05）（图2A）。平板克隆结果显示，相对于阴性对照组，si-Ezrin 组胃癌细胞克隆数目减少，HY-101299B 组胃癌细胞克隆数目增多；相对于si-Ezrin 组，si-Ezrin+HY-101299B 组胃癌细胞克隆数目增多（均P＜0.05）（图2B）。Transwell 结果显示：各组胃癌细胞侵袭数目差异无统计学意义（P＞0.05）（图2C）。

2.3 沉默Ezrin对YAP及其下游相关基因的mRNA与蛋白的表达的影响

qPCR 结果显示，相对于阴性对照组，si-Ezrin组胃癌细胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表达下降，HY-101299B 组胃癌细胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的mRNA 水平表达升高；相对si-Ezrin 组，si-Ezrin+HY-101299B 组胃癌细胞中YAP、 Mst、 WW45、Lats1、 Lats2 和TEAD 的 mRNA 水平表达升高（均P＜0.05）（图3A）。Western blot 结果显示，相对于阴性对照组，si-Ezrin 组胃癌细胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表达下降，HY-101299B 组为癌细胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的对蛋白水平表达升高；相对si-Ezrin 组，si-Ezrin+HY-101299B 组胃癌细胞中YAP、Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD 的蛋白水平表达升高（均P＜0.05）（图3B）。

3 讨论

在中国，胃癌是最常见的消化道肿瘤，且每年发病率呈不断上升趋势[17]。由于肿瘤本身的侵袭与淋巴结转移以及术后的复发转移现象，给常规治疗带来了极大的困难，并直接导致了胃癌患者整体的不良预后和较高病死率[18]。因此，深入研究胃癌侵袭、转移的机制，对于筛选新的胃癌诊断和治疗的靶分子，提高胃癌诊疗效果具有十分重要的临床意义。

肿瘤细胞获得侵袭性、从原发灶脱离是肿瘤转移侵袭的关键，这个过程是通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 实现的。EMT 是指具有上皮表型的细胞由于极性消失、细胞间连接丢失、细胞骨架重排从而表现出间质细胞样特征的生理病理学过程[19]。EMT 与肿瘤发生发展具有密切关系，调节多种肿瘤细胞特性，如抗衰老和死亡、耐药、免疫逃避、干细胞特性的获得与维持、肿瘤相关性炎症和免疫抑制等[20]。Ezrin 为细胞骨架连接蛋白，参与细胞黏附、生长、分化等的调节[21-22]。Ezrin 蛋白是ERM 蛋白家族中首先被发现的成员。研究[23]发现，Ezrin 对主要通过胞内E-cadherin 累积的方式，激活的Ezrin 使Ecadherin 在细胞内聚集而细胞表面E-cadherin 减少，使得依赖后者形成的细胞与细胞间连接破坏，在肿瘤细胞脱离原发灶中发挥作用。研究[24]表明，Ezrin 蛋白高表达时，肿瘤细胞的侵袭转移能力增强；反之，其表达水平较低时，肿瘤的侵袭转移能力亦较弱。笔者前期研究发现，Ezrin 蛋白在胃癌组织中表达水平明显高于癌旁组织，并与肿瘤的发生发展密切相关。该结果表明，Ezrin 是胃癌中的一个明确的癌基因。本研究胃癌细胞中进一步观察发现，沉默Ezrin 后胃癌细胞的增殖发生显著降低，然而，胃癌细胞的侵袭能力没有显著变化，推测在细胞水平沉默Ezrin 不影响胃癌细胞的迁移，可能与胃的特殊酸性环境相关。后续研究将在此方面进一步探讨。

Hippo 信号通路是一个高度保守的控制生长的信号通路，在胚胎发育、组织分化、细胞增殖、凋亡、自噬、耐药、干细胞形成、转移、EMT 及血管新生等方面发挥关键作用[25-27]。大多数Hippo通路分子组成高度保守，包括Mst、WW45、Mob、Lats、YAP 和TEAD[28]。YAP1 蛋白细胞核高表达预示胃癌患者预后较差，并且YAP1 在早期胃癌和肠型胃癌中表达较高，是肠型胃癌患者预后不良的独立因素[29-30]。

本研究显示，将胃癌细胞中的Ezrin 敲低后，胃癌细胞的增殖减慢的同时YAP 及其下游相关分子（Mst、WW45、Lats1、Lats2 和TEAD）的表达显著降低。重新激活YAP 后，沉默Ezrin 导致的增殖抑制作用消失。综上所述，Ezrin 是胃癌中的致癌因子，且其发挥作用是通过YAP 信号通路实现的。本研究通过分析了Ezrin 蛋白与YAP 的交互作用在胃癌发生发展中的作用、机制和临床意义，为胃癌靶向治疗提供新的靶标，以期进一步提高胃癌的疗效。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：单汉国负责实验设计、实验指导、审核和修改论文，覃一晋负责文献查阅、实验实施及论文撰写，陈茂良负责实验实施、数据的收集和统计学分析，王春云、阳乐彬负责技术、材料支持，彭肃负责指导实验、审核和修改论文。