BRD4 通过靶向GSTP1 调控食管癌TE-1细胞顺铂敏感性

张献棣 陈明军

作者单位：212000 江苏大学京江学院检验科

食管癌是常见恶性肿瘤类型, 全球每年新发约60 万例, 因其死亡人数超54 万例, 其中我国约占50%［1］。由于早期症状不明显, 缺少浆膜易侵犯和转移, 治疗后复发率较高, 食管癌患者5 年总体生存率为25%～47%［2,3］。目前在新辅助以及中晚期食管癌患者综合治疗方案中化疗无疑发挥着关键作用, 因此提高化疗效果以及识别早期复发的危险因素将对最终改善患者预后有重要的意义。溴结构域蛋白4(bromodomain containing 4, BRD4)是识别蛋白赖氨酸乙酰化残基的关键结构蛋白, 可广泛调节表观遗传修饰和基因转录的众多分子进程, 近来被认为是淋巴瘤、肝癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的潜在治疗靶标, 但其在食管癌发生、发展过程中的作用研究较少［4-7］。本研究中首次聚焦于BRD4 对食管癌化疗敏感能力的影响, 基于生物信息学数据分析BRD4 在食管癌中的表达水平及其与化疗药物关键解毒酶GSTP1 之间的联系, 结合靶向处理探究BRD4 在食管癌细胞顺铂敏感性调控中作的作用及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及培养条件 TE-1 购自于上海中乔新舟生物科技, 并附有短串联重复序列鉴定检验报告；TE-1 细胞培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)1640 基础培养基, 添加终浓度为1%青霉素和链霉素(双抗), 置恒温培养箱37℃、5% CO2条件下培养和传代。

1.1.2 主要耗材和试剂 细胞及转染专用Opti MEM 培 养 基、双 抗( 美 国Gibco 公 司)；FBS( 以 色列Biological Industries 公司)；磷酸盐缓冲溶液(PBS)、二甲基亚砜(DMSO)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、细胞高效RIPA 裂解液、Western blot 实验相关试剂(北京索莱宝公司)；蛋白酶抑制剂Cocktails(美国ApexBio 公司)；高敏型ECL 化学发光检测曝光液、180 kDa 蛋白Marker(南京诺唯赞公司)；顺铂(Cisplatin, DDP)、(+)-JQ1 粉剂(上海Selleck 公司)；一抗稀释液(苏州新赛美生物科技有限公司)；兔抗人B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2 关联X 蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、谷 胱 甘 肽 硫 基 转 移 酶P1(Glutathione S-transferase P, GSTP1) 和 鼠 抗 人GAPDH抗体(武汉三鹰公司)；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 切割体(cleaved-caspase-3)抗体(美国CST 公司)；兔抗人BRD4 抗体(美国abcam 公司)；HRP 偶联的抗鼠和抗兔二抗(南京川博公司)； LipofectamineTM2000 转染试剂(美国ThermoFisher 公司)；siRNA-BRD4(5'-GGAGA UGACAUAGUCUUAATT-3')、siRNA-GSTP1(5'-ACACC GTGGTCTATTTCCCAGTTCG-3')以及阴性对照(上海生工生物工程有限公司)；增强型CCK-8(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学验证 利用TCGA 数据库(https://portal.gdc.cancer.gov) 获 取TCGA-ESCA 项 目STAR 流程的RNAseq 数据并提取TPM 格式的数据, 样本中共174 例肿瘤组织, 11 例癌旁正常组织, 采用R (4.2.1)版本, R 包：ggplot2［3.3.6］, stats［4.2.1］, car；根据数据格式特征选择独立样本t 检验进行统计并进行数据可视化, 配对样本采用配对样本t 检验：提取对应编号配对的癌旁和癌样本(共计8 对), 数据处理方法：log2(value+1)；利用GEPIA2 在线分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析BRD4 与GSTP1 分子表达相关性：设置相关系数为Pearson。

1.2.2 siRNA 及药物处理 将TE-1 细胞接种于6 孔板中, 待细胞覆盖率达50%左右更换为不含双抗培养基, 将细胞分为3 组：阴性对照组(Negative control, 转染无序序列)、干扰BRD4 组(转染siRNA-BRD4)；干扰GSTP1 组(转染siRNA-GSTP1)进行处理, 取适量LipofectamineTM2000 和各siRNA 溶液混合于Opti MEM培养基中转染处理细胞6 h, 去除转染试剂继续培养24 h 进行后续实验；待6 孔板TE-1 细胞数目至70%～80%左右, 去除培养基PBS 清洗后分别加入稀释后含不同浓度(+)-JQ1 (25、50 和100 nM), 对照组加入等体积DMSO；(+)-JQ1 预处理对DDP 杀伤影响：采取(+)-JQ1(50 nM) 处理24 h 后加入DDP (5 μg/ml, 最高浓度液由无菌水现配现用)或等体积无菌水继续处理24 h 进行后续实验；以上实验均重复3 次或设置3 个以上复孔。

1.2.3 Western blot 检测TE-1 细胞中凋亡相关蛋白经不同实验处理后TE-1 细胞总蛋白用含有PMSF 和蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解提取, 经12%或15%浓度SDS-PAGE 胶电泳后转PVDF 膜于含0.5%脱脂奶粉TBST 液中室温封闭1 h, 凋亡相关抗体根据说明书推荐稀释后4℃孵育PVDF 膜过夜, TBST 洗膜后孵育对应二抗(稀释比为1∶8000)室温孵育1 h 后继续洗净即可采用ECL 化学发光自显, 利用软件将目的条带灰度数值化, 并与GAPDH 的灰度值作归一化处理后计算各蛋白表达差异。

1.2.4 CCK-8 实 验 检 测(+)-JQ1 预 处 理 对TE-1 细胞DDP 敏感性的影响 将3×103个TE-1 细胞接种于96 孔 板 每 孔 中, 随 机 分 为2 组：(+)-JQ1 处 理 组(50 nM)以及对照组(等体积DMSO 溶液), 设置5 个复孔分别继续培养, 24 h 后将DDP 按浓度梯度(3.125、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/ml)加入处理24 h, 并于处理结束后每孔加10 μl 的CCK-8 溶液, 避光振荡孵育0.5～1.0 h 后在酶标仪上分别检测450、650 nm 波长下每孔吸光度值, 650 nm 作为参考波长进行双波长测定, 分 组 间 使 用R 包：ggplot2［3.3.6］, drc［3.0-1］分别计算细胞活性(百分数), 拟合模型(log-logistic法)计算DDP 的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值［8］。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 如果数据符合正态分布则通过方差齐性检验, 两组以上比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 独立样本采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学数据库分析食管癌中BRD4 表达水平 TCGA 数据解析后结果显示, 食管癌肿瘤组织中BRD4 的mRNA 总体表达水平相较于癌旁正常组织有明显升高［(5.61±0.57)VS(4.80±0.59)］, 差异有统计学意义(P=0.0000＜0.001)。见图1A。进一步通过对比配对肿瘤和癌旁正常组织样本发现, 食管癌患者食管癌组织中BRD4 表达水平(5.57±0.31)普遍显著高于其癌旁正常组织的(4.77±0.44), 差异有统计学意义(P=0.0016＜0.01)。见图1B。

2.2 食管癌中BRD4 与GSTP1 表达的联系 为揭示BRD4 与食管癌化疗敏感性的联系, 本研究使用GEPIA2 数据库发现, 在食管癌化疗药物耐药形成过程中关键解毒结合酶GSTP1 与肿瘤组织中BRD4 表达呈正相关(r=0.26, P=0.00029＜0.001)。见图2A。结合靶向siRNA 处理Western blot 结果显示, siRNA-BRD4 处理后食管癌TE-1 细胞中BRD4 和GSTP1 的表达水平较NC 组均有明显升高, 而siRNA-GSTP1 后TE-1 细胞中GSTP1 表达下调未对BRD4 蛋白产生明显影响。见图2B。进一步采取BRD4 靶向抑制剂的梯度浓度处理证实, 伴随(+)-JQ1 浓度升高TE-1 细胞中GSTP1 蛋白的表达水平较阴性对照组出现明显下降趋势, 而由于(+)-JQ1 主要是通过结合于BRD4 的溴结构域发挥作用,仅在最高浓度处理(100 nM)组食管癌细胞中BRD4 出现表达抑制作用。见图2C。

图2 食管癌中BRD4 与GSTP1 表达之间联系

2.3 (+)-JQ1 增强DDP 对食管癌TE-1 细胞的杀伤作用 低浓度的(+)-JQ1(50 nM)处理可引起食管癌TE-1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达下调以及凋亡相关蛋白Bax 表达上升, 但对caspase-3 并无明显影响, 而在与DDP 联合应用时可见caspase-3 的活化形式cleavedcaspase-3 的相比DDP 单独使用组细胞有显著表达上调。Western blot 结果表明, (+)-JQ1 预处理抑制BRD4的功能可以提高DDP 对食管癌细胞的杀伤作用。见图3。

图3 (+)-JQ1 预处理对DDP 杀伤TE-1 细胞的影响

2.4 靶向抑制BRD4 提高TE-1 细胞对DDP 的敏感性 CCK-8 结果显示, 食管癌TE-1 细胞经抑制BRD4蛋白功能［(+)-JQ1, 50 nM, 24 h］预处理后可显著提高对化疗药物DDP 的敏感性, DMSO 对照组DDP 的IC50值为(19.43±0.59)μg/ml, 而(+)-JQ1 预处理后降至(10.46±0.24)μg/ml, 差异有统计学意义 (P＜0.05)。以上结果表明, 食管癌细胞中BRD4 可能参与对化疗药物DDP 敏感性调控。见图4。

图4 (+)-JQ1 预处理对TE-1 细胞对DDP 的IC50 值影响

3 讨论

BRD4 作为溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extra-terminal domain, BET)蛋白家族中研究较为广泛的结合蛋白之一, 主要通过其N 端两个串联溴结构域(bromodomains, BDs)即BD1 和BD2 与组蛋白质或非组蛋白质(主要为转录调控因子)上已发生乙酰化修饰的赖氨酸残基相结合, 进而招募、活化正转录延伸因 子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb)到启动子近端区域(promoter-proximal regions)磷酸化RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, PolⅡ)介导基因转录和延伸, 从而发挥调节胚胎发育、细胞增殖、代谢调控和免疫应答等作用［9-11］。因此, BRD4 的表达和功能失调与多种疾病有关, 包括癌症、免疫紊乱和代谢疾病等, 尤其是在肿瘤细胞中高表达的BRD4 主要通过调控程序性细胞死亡(program cell death, PCD)进程参与众多类型肿瘤的发生与进展［12-17］。本研究中通过整理TCGA 数据库中食管癌相关信息解析后发现, 食管癌组织中BRD4 的mRNA 表达整体水平明显高于癌旁正常组织；配对样本数据也显示, 与正常组织相比同一患者的肿瘤样本中BRD4 出现明显上调。目前肿瘤研究表明, 对于肝癌、胃癌、结直肠癌、肺癌等患者而言, 高表达的BRD4 常与其不良预后存在密切联系［4,6,7,18］。已有食管鳞癌相关数据指出, 异常高表达的BRD4 蛋白可以通过形成复合体直接结合到染色体 浓 缩 调 节 蛋 白2(chromosome concentration regulatory protein 2, RCC2)的启动子区域, 进而上调有丝分裂所必需的分子RCC2 的表达以促进肿瘤细胞的持续增殖［19］。然而, 对于食管癌中高表达的BRD4 是否参与治疗拮抗形成, 特别是化疗疗效是否存在影响尚缺乏相关探讨和论证。

食管癌早期诊断率偏低, 多数患者初次就诊时已处于中晚期, 丧失了手术干预的意义, 除此之外超过50%的早期患者会在手术后发生复发或转移, 因此化疗成为食管癌综合治疗中的重要手段之一［20,21］。其中, DDP 作为核心成分与其他药物形成的不同组合是目前中晚期食管癌患者术后辅助化疗标准方案, 但其临床实际疗效存在显著个体差异, 且整体预后水平仍较差［22］。近年来的研究发现, 以GSTP1 为代表的一类药物代谢酶通过催化谷胱甘肽和亲脂性化合物与亲电中心之间的反应, 提高亲电子细胞毒物的水溶性, 促进铂类药物代谢, 从而影响化疗疗效［23,24］。本研究基于GEPIA2 数据论证发现, 食管癌组织中BRD4 与GSTP1表达之间存在显著正相关关系。由于BRD4 在众多类型肿瘤中表现出的基因表达调控作用, 本研究首先通过靶向siRNA 干扰处理发现, 在食管癌细胞中下调BRD4 处理后观察到GSTP1 的表达抑制, 但siRNAGSTP1 处理对BRD4 表达无显著影响。进一步通过梯度浓度的BRD4 靶向抑制剂处理证实, 食管癌中BRD4蛋白功能稳定是维持GSTP1 持续表达的重要分子基础。近来研究证实, 在包括多种血液系统癌症以及实体瘤中BRD4 可直接结合到Bcl-2 基因的启动子和超增强子区域, 促进凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表达。后续研究中也初步证实, 低浓度的(+)-JQ1 预处理即可下调Bcl-2 蛋白的表达, 同时后者阻抑蛋白Bax 出现一定程度的上调, 而(+)-JQ1 预处理可显著增强DDP 的杀伤作用。CCK-8 的细胞毒性实验与上述结果相一致, 表明BRD4 在食管癌细胞DDP 敏感性调控中发挥重要作用。

本研究首次在食管癌中发现高表达BRD4 与化疗敏感性关键酶GSTP1 表达之间存在联系, 当然也存在部分局限性, 例如无法有效回顾性分析BRD4 表达与食管癌患者预后的联系以及化疗方案疗效评估的临床意义。然而, 本研究作为基础研究, 初步验证了BRD4对GSTP1 表达的调控作用, 同时论证了BRD4 靶向抑制对提高食管癌细胞DDP 敏感性的作用, 对接受以DDP 作为基础的食管癌化疗患者的预后评估具有潜在的临床指导意义。