基于利什曼原虫K26重组抗原检测黑热病特异抗体的免疫层析试条方法的建立与效果评价

石 锋,丁 丹,高春花,张 璟,贾孝凯,王 颖,危芙蓉

内脏利什曼病俗称黑热病,在全球广泛区域导致严重的公共卫生问题,也严重危害我国西部人民的健康和生命[1]。准确、早期诊断对黑热病的治疗和控制至关重要。建立合适的黑热病检测方法满足临床快速诊断和现场流行病学调查的需要是当务之急。在传统的病原学、免疫学和分子生物学方法中,免疫层析试条法更为简便,快捷可靠[2-4]。研究表明,K26蛋白是一种对黑热病具有特异性的高抗原性蛋白,本课题组对我国利什曼原虫分离株K26抗原进行了基因克隆和蛋白表达,ELISA结果显示检测黑热病的敏感性和特异性均接近90%或以上。链球菌G蛋白(SPG)能特异地同免疫球蛋白IgG分子的Fc段结合而不影响其Fab段与抗原分子结合的能力,是一种高效的用于抗体检测、纯化、清除的蛋白。本研究以我国利什曼原虫K26重组抗原作为包被抗原,以胶体金标记链球菌G蛋白作为检测探针,检测内脏利什曼病特异抗体的免疫层析试条法,并对其检测效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 人用rK39免疫层析试条购自美国InBios公司;利什曼原虫pET32a-K26-SC6重组质粒为本实验室保存;组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)为GE healthcare公司产品,链球菌G蛋白(SPG)、兔抗SPG购自美国GE公司;硝酸纤维素(NC)膜、交联释放垫(GFCP20300)、吸水垫(CFSP223000)和样品垫(GRADE2)为美国Millipore公司产品。氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)(沪试牌)购自上海国药集团化学试剂有限公司。XZ1000型喷膜机为美国Bio-Dot公司产品。

1.2 血清样品 病原学确诊内脏利什曼病患者血清110份,其中新疆喀什、四川九寨沟县和新疆伽师县血清分别为35、45和30份。疟疾患者血清、细粒棘球蚴病、日本血吸虫病患者血清各10份,弓形虫病、并殖吸虫病和华支睾吸虫病患者血清各5份为实验室保存的阳性血清,健康人血清40份。

1.3 rK26重组抗原的制备 将转化有 pET32a-K26-SC6 重组质粒的E.coliBL21(DE3) 感受态细胞过夜培养后, 随机挑选菌落, 于 LB-Amp 培养基培养至 OD600=0.6 时, 加入1 mmol/L IPTG,28 ℃诱导4 h,用蛋白抽提剂、蛋白酶抑制剂、溶菌酶和核酸酶裂解表达细菌,Ni-NTA树脂亲和纯化表达产物。12% SDS-PAGE 检查重组蛋白表达情况后测纯化蛋白浓度,-30 ℃保存备用。

1.4 rK26免疫层析试条的制备 用胶体金标记SPG,将利什曼原虫 K26 重组抗原(检测线)和兔抗 SPG(对照线)分别喷涂在 NC 膜上适当位置制成胶体金免疫试条[5]。

1.5 rK26免疫层析试条检测条件的选取 将适量样本血清加在样品垫上,然后滴加适量样本稀释液,适时观察并记录检测结果。

1.6 rK39试条的检测方法 rK39试条检测方法按照试剂盒说明书进行操作。简言之,取20 μL待检血清滴于试条样品垫上,吸干后再加 2～3 滴(约150 μL)chase 缓冲液。质控带和检测带均出现红色条带,判为阳性,只有质控带出现红色条带则判为阴性,如果质控带不出现红色条带则说明试条失效。检测结果均在15 min内判断。

1.7 统计学分析 采用SAS 9.4 软件对2种试条的检测结果进行χ2检验和一致性检验,检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 rK26重组抗原的制备 K26-SC6基因片段长度为404个碱基(Accession no.MN688116),推测编码的氨基酸个数为134个。推导的氨基酸序列如下:TKDSAKKPQKRADNIHKTTETNHRGA-AGVPPKHAGGAMNDSALKEDGHTQKNDGGA-PKEDGHTQKNDGDGPKEDDHAHNDGDGPKE-DDHAHNDGDGPKEDDHAHNDGGGPKEDDH-AHNDGGG PKEGENLQQNDG。rK26重组抗原的表达和纯化情况如图1。

M为标准蛋白分子量;1为未诱导全细胞; 2为IPTG诱导全细胞;3为诱导全细胞裂解上清; 4为诱导全细胞裂解沉淀; 5为纯化后的重组蛋白。图1 K26-SC6重组蛋白表达和纯化的12% SDS-PAGE电泳分析Fig.1 SDS-PAGE (12%) analysis of pET32a-K26-SC6 expressed in E. coli BL21 cells

2.2 rK26试条的制备 检测线上的利什曼原虫K26重组抗原工作浓度为1.3 mg/mL,喷涂量为1 μL/cm;质控线二抗抗体(兔抗SPG)工作浓度为1.0 mg/mL,喷涂量为1 μL/cm;链球菌G蛋白(SPG)探针的工作浓度(以蛋白浓度计):100 μg/mL,喷涂量为40 μL/cm。

2.3 rK26试条的检测条件 每次检测取5 μL血清,缓慢滴加4滴(120～200 μL)样本稀释液。只要检测带出现红色条带, 不论强弱即判为阳性, 否则为阴性。检测结果均在15 min 内判断。

2.4 rK26试条法和rK39试条法检测结果 rK26试条法和rK39试条法对内脏利什曼病患者血清、健康人血清和其他寄生虫病患者血清进行检测,部分检测结果如图2。

卡板:rK26 绿色试条:rK39图2 rK26试条法和rK39试条法部分检测结果Fig.2 Results of rK26 and rK39 strip tests

rK26试条法和rK39试条法检测内脏利什曼病患者血清的敏感性分别为91.82%(101/110)和93.64%(103/110);与10份疟疾患者血清、10份日本血吸虫病患者血清、10份细粒棘球蚴病患者血清、5份弓形虫病患者血清、5份并殖吸虫病患者血清和5份华支睾吸虫病患者血清均无交叉反应,40份健康者血清也均为阴性,总特异性为100.00%(表1)。

表1 rK26试条法和rK39试条法检测寄生虫病患者和健康人血清Tab.1 Detection results of sera from different patients and controls with the rK26 and rK39 immunochromatographic strip tests

2.5 rK26试条法和rK39试条法检测黑热病患者血清结果比较 rK26试条法和rK39试条法共检

测110份黑热病患者血清,二者均检测阳性的例数为100份,均为阴性的例数为7份。rK26试条法检测出的101份内脏利什曼病患者血清中,rK39试条法有1份显示阴性,rK39试条法检测出的103份内脏利什曼病患者血清中,rK26试条法有3份显示阴性(表2)。rK26试条法和rK39试条法检测黑热病患者血清敏感性之间差异无统计学意义(χ2=0.25,P=0.62),2种试条法检测黑热病患者血清的结果一致性较好(κ=0.73)。

表2 rK26试条法和rK39试条法检测内脏利什曼病患者血清结果比较Tab.2 Comparison of detection results in sera from patients with visceral leishmaniasis with the rK26 immunochromatographic strip or rK39 immunochromatographic strip

3 讨 论

以骨髓、脾等穿刺物涂片染色镜检、体外原虫培养和易感动物接种等病原学检查是内脏利什曼病最古老的诊断方法,迄今仍是内脏利什曼病诊断的“金标准”。但这些方法敏感性较低,对专业技术人员要求较高,容易漏检、误检,而且对患者有一定的伤害风险,并不适合现场应用。致内脏利什曼病的利什曼原虫感染能诱导人、犬产生较强的体液免疫反应,据此常以免疫学方法检测利什曼原虫特异抗体,以检测利什曼原虫感染,具有很高的敏感性[6]。但免疫学方法中如间接荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验、免疫印迹等方法耗时,需要特殊的材料和设备,难以广泛使用,而免疫层析试条法更为简便,快捷可靠,特别适合在基层和现场使用,成为近年来推广迅速的新技术。Burns JM等[7]从恰氏利什曼原虫的类Kinesin基因中获得了基因片段K39,并证实其存在于所有引起内脏利什曼病的利什曼原虫虫种(株)中。美国InBios公司以此基因片段的重组抗原K39制备的rK39免疫层析试条在现场应用中取得较好的效果[8-9],是目前唯一商品化的快速检测内脏利什曼病的产品,但K39基因只在发病时(有症状)表达,因此,该产品不能应用于流行病学调查,应用存在局限性[10-11]。另外,rK39试剂盒价格昂贵,而黑热病多发于贫困国家和地区,患者难以负担较高费用,从而限制了该试剂盒的推广和普及。

K26蛋白也被称为亲水性酰化表面蛋白B(hydrophilic acylated surface protein B,HASPB),K26抗原编码基因编码含有多个由10～11个氨基酸残基构成的重复序列[12]。同地区的利什曼原虫26蛋白重复区数量、顺序和排列不同,且同是婴儿利什曼原虫的不同虫株中K26蛋白观察到的重复序列也不同[13]。有报道表明K26蛋白是一种对内脏利什曼病具有特异性的高抗原性蛋白,对利什曼原虫无症状感染也有很好的检测效果[11],但用于血清学诊断黑热病的K26抗原最好是来自当地利什曼原虫虫株[14]。本课题组对我国3种类型黑热病流行区利什曼原虫分离株K26抗原分别进行了基因克隆和蛋白表达,ELISA结果显示检测黑热病患者血清的敏感性均为90%以上,而对疟疾、日本血吸虫病、细粒棘球蚴病、弓形虫病、并殖吸虫病和华支睾吸虫病患者血清均无交叉反应,40份健康者血清也均为阴性,特异性均高达100%。来源于我国3种类型内脏利什曼病流行区的利什曼原虫K26重组蛋白对黑热病患者血清的阳性检出率之间的差异无统计学意义(χ2=0.53,P=0.77),且3种K26抗原对源自新疆喀什(人源型黑热病流行区),四川(人犬共患型黑热病流行区)和新疆伽师(野生动物源型黑热病流行区)的黑热病患者血清的检测结果之间的差异均无统计学意义。

本研究以利什曼原虫K26重组抗原(SC6株)作为包被抗原,以胶体金标记SPG为检测试剂,成功建立了检测内脏利什曼病的免疫层析试条,该试条检测内脏利什曼病患者血清的敏感性为91.82%(101/110),检测其他寄生虫病患者血清和正常人血清也表现出很好的特异性,高达100%。与平行检测的rK39试条法之间无论是敏感性还是特异性的差异均无统计学意义。2种试条法检测黑热病患者血清的结果一致性较好(κ=0.73)。

本研究制备的内脏利什曼病检测免疫层析试条,血清用量较rK39试条少,在样品垫部分使用特殊滤血纸,可以有效过滤掉全血中的红细胞,避免红细胞在检测中对判读结果造成干扰,这样在检测过程中可以无需分离血清,直接采全血即可进行检验,可增加受试者依从性,方便基层和现场的使用。以后还需在现场扩大测试,以作进一步评价。

利益冲突：无