PKD通过ERK1/2信号通路调控单核细胞增生李斯特菌感染Caco-2细胞

李家政,张峰源,许晶晶,姜旭淦,陈盛霞

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)简称单增李斯特菌,是一种革兰阳性细胞内细菌,可导致侵袭性李斯特菌病。Lm可在人体内无症状定植,健康人可能会出现自限性的胃肠炎,但免疫功能低下的患者、老年人、孕妇和新生儿则表现出发热性胃肠炎、菌血症、败血症、脑膜炎和胎儿死亡等症状,致死率高达20%～30%[1-2]。Lm从低水平抑制感染状态到暴发性疾病发作的转变机制尚不清楚。目前研究表明,肠道微生物群的组成[3-4]、肠道粘液屏障[5]、小肠分泌细胞分泌抗菌蛋白和防御肽[6-7]、诱导激活NLRP3炎症小体从而增加促炎细胞因子的成熟和释放[8]等均可抵抗Lm感染,这可能是导致Lm无症状定居和长潜伏期的因素。

蛋白激酶D(protein kinase D,PKD)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,哺乳动物中有3种亚型:PKD1、PKD2和PKD3。PKD现已成为甘油二酯(diacylglycerol,DAG)网络中的关键信号节点,可被多种细胞刺激激活,影响细胞基本功能,包括分泌、迁移、增殖、存活、血管生成和免疫反应等[9]。但对于PKD在Lm感染时所发挥的功能,尚无文献报道。

穿越肠道屏障是Lm致病的第一步,也是最关键的一步。肠道上皮细胞炎症因子的激活和释放、紧密连接蛋白的表达和重塑、上皮细胞更新等对Lm侵袭和穿过肠上皮细胞屏障非常重要[10-11]。由于Caco-2细胞体外培养汇合形成细胞单层,表现出紧密连接介导的屏障功能及顶端刷状缘形态等特征,现被广泛用作肠道屏障的模型[12]。此实验通过探讨Lm感染对Caco-2细胞PKD表达的影响,研究PKD在调控Lm感染Caco-2细胞存活率和炎症中的作用及机制,为进一步研究PKD在Lm穿过肠道上皮细胞屏障时的功能以及发现治疗Lm靶点提供新思路。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞 Lm EGD株由天津医科大学申艳娜教授惠赠,甘油菌保存于-80 ℃冰箱。Caco-2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司,液氮中长期保种。

1.2 主要试剂 Caco-2细胞专用培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司;脑心浸出液肉汤(brain heart infusion,BHI)培养基购自北京陆桥技术股份有限公司;CCK-8、RNA-easy Isolation Reagent、HiScript III RT SuperMix for qPCR、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒均购自南京诺维赞生物科技有限公司;PKD抑制剂CID755673购自美国MCE公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、羊抗鼠辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)二抗和羊抗兔HRP二抗购自北京康为生物科技有限公司;ERK1/2抗体购自沈阳万类生物科技;IκBα抗体购自杭州华安技术有限公司;p-ERK1/2、p-IκBα抗体购自美国CST公司;NLRP3抗体购自德国Novus公司。

1.3 Caco-2细胞和Lm的培养 Caco-2细胞接种于细胞培养皿中,用Caco-2细胞专用培养基置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养,2～5 d传代1次,取第3-6代生长状态良好且汇合度达90%的细胞用于实验。Lm接种于灭菌BHI培养液中,37 ℃ 250 r/min恒温空气浴摇床培养増菌至Lm处于对数生长期(菌液OD600值为0.7～0.8),取出菌液,离心后用无菌PBS洗涤沉淀2次,然后用PBS重悬并调整菌悬液OD600=1用于实验,此时细菌浓度约为1×109CFU/mL。

1.4 Lm感染Caco-2细胞模型 Caco-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中。按1.3制备Lm的PBS菌悬液,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、10、100感染Caco-2细胞,共孵育2 h后加入终浓度为100 μg/mL庆大霉素杀死胞外菌,杀菌45 min后用无菌PBS轻柔洗涤2次,加入无抗生素完全培养基继续培养。以加入Lm为计时起点,收集3 h、6 h、9 h、12 h细胞提取RNA。

1.5 qRT-PCR检测PKD mRNA表达 根据RNA-easy Isolation Reagent试剂盒操作说明提取细胞总RNA,利用HiScript III RT SuperMix for qPCR试剂盒制备cDNA,按AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒操作进行qRT-PCR扩增。扩增参数设置,预变性:95 ℃ 5 min;循环反应:95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环;熔解曲线:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。统计荧光值,用2-ΔΔCt计算目的基因的表达量。PKD1、PKD2和PKD3引物来源于PrimerBank数据库(https://pga.mgh.harvard.edu/ primerbank/index.html),GAPDH为内参基因,引物序列见表1,引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 实验所用引物Tab.1 Primer information

1.6 实验分组 实验分NC组、Lm组、Lm+DMSO组和Lm+CID755673组。NC组:即细胞对照组,Caco-2细胞常规培养;Lm组:即感染组,以MOI=100 Lm感染Caco-2细胞,方法同1.4;Lm+DMSO组:即DMSO对照组,先用含0.01% DMSO完全培养基孵育Caco-2细胞2 h,再进行MOI=100 Lm感染;Lm+CID755673组:即CID755673抑制剂组,先用含实验设定CID755673浓度的完全培养基孵育Caco-2细胞2 h,再进行MOI=100 Lm感染。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖 Caco-2细胞以3×103个/孔接种于96孔板中,按照1.6操作处理各组细胞,以加入Lm为计时起点。9 h后向每孔加入10 μL CCK-8试剂,孵育4 h后酶标仪检测450 nm处的吸光值。

1.8 Western blot法检测蛋白表达 Caco-2细胞以5×105个/孔接种于6孔板中,按照1.6操作处理各组细胞,以加入Lm为计时起点,收集9 h细胞提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。以每孔80 μg蛋白上样,100 V恒压电泳至蛋白完全分离后,以350 mA恒流冰浴转膜90 min;5%脱脂奶粉封闭1 h,TBST洗膜3次(10 min/次);加入一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次(10 min/次);再加入相应HRP标记的二抗,摇床室温孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次)后ECL显色检测蛋白表达情况,并用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度分析。

2 结 果

2.1 Lm感染促进Caco-2细胞表达PKD 为确定Lm感染对Caco-2细胞PKD表达的影响以及建立Lm感染Caco-2细胞模型,我们用qRT-PCR法检测不同MOI(1,10,100)的Lm感染细胞3 h、6 h、9 h和12 h时细胞表达PKD的变化。当Lm感染Caco-2细胞9 h,MOI=10和100时PKD1、PKD2和PKD3 的mRNA表达水平均显著增高,其中MOI=10时PKD1的mRNA水平最高、MOI=100时PKD2和PKD3的mRNA水平最高(FPKD1=15.33,FPKD2=52.79,FPKD3=23.23,均P<0.05)(图1A)。当MOI=100,Lm感染Caco-2细胞9 h和12 h时PKD1、PKD2和PKD3的mRNA表达水平均显著增高,其中PKD1和PKD2的mRNA水平在12 h最高,PKD3的mRNA水平在9 h最高(FPKD1=21.85,FPKD2=179.0,FPKD3=69.52,均P<0.05)(图1B)。结果表明,Lm感染促进Caco-2细胞表达PKD。综合以上结果,以MOI=100、感染时间9 h建立Lm感染Caco-2细胞模型进行后续实验。

注:A为不同MOI(1,10,100)Lm感染Caco-2细胞9 h;B为MOI=100 Lm感染细胞3 h、6 h、9 h、12 h。①P<0.05,②P<0.01,③P<0.001,ns无统计学差异。图1 Lm感染Caco-2细胞PKD mRNA表达水平Fig.1 PKD mRNA level in Caco-2 cells infected with Listeria monocytogenes

2.2 抑制PKD降低Lm感染的Caco-2细胞存活率 为进一步探索PKD在Lm感染Caco-2细胞中的作用,我们采用CCK-8法测定PKD抑制剂CID755673对Lm感染Caco-2细胞存活率的影响。与Lm组相比,细胞存活率随CID755673浓度升高而降低(F=4.831,P<0.05)(图2)。结果表明,Lm感染Caco-2细胞时,PKD是细胞存活的重要调节蛋白,抑制PKD可降低细胞存活率。选择后续实验的CID755673浓度为10 μmol/L。

注:①P<0.05。图2 PKD抑制对细胞存活率的影响Fig.2 Effect of PKD inhibition on cell viability

2.3 抑制PKD导致Lm感染的Caco-2细胞炎症蛋白表达减少 已有研究结果表明Lm感染能快速激活细胞炎症通路[13-14],但此过程中PKD是否发挥作用尚不清楚。我们采用Western blot法检测PKD对Lm感染Caco-2细胞炎症相关蛋白表达的影响。与NC组相比,Lm组细胞NLRP3和p-IκBα蛋白表达增加。与Lm组相比,Lm+CID755673组细胞NLRP3和p-IκBα蛋白表达显著减少(FNLRP3=35.02,Fp-IκBα=45.19,均P<0.01;FIκBα=4.124,P>0.05)(图3)。结果表明,Lm感染Caco-2细胞时,PKD是调节细胞炎症的重要因子,抑制PKD可减少细胞炎症相关蛋白的表达。

注:②P<0.01,③P<0.001。图3 PKD抑制对细胞炎症蛋白表达的影响Fig.3 Effect of PKD inhibition on inflammatory protein expression

2.4 抑制PKD可抑制Lm感染的Caco-2细胞ERK1/2信号通路 以上结果(图2和图3)表明,Lm感染Caco-2细胞时,PKD可调节细胞存活率和炎症,但具体机制尚不清楚。我们采用Western blot法检测PKD对Lm感染Caco-2细胞ERK1/2信号通路的影响。与NC组相比,Lm组细胞p-ERK1/2蛋白表达增加。与Lm组相比,Lm+CID755673组细胞p-ERK1/2蛋白表达显著降低(F=326.9,P<0.001)(图4)。结果表明,Lm感染时,PKD是ERK1/2信号通路上游的重要调节蛋白,Lm感染激活的ERK1/2信号通路可被PKD抑制剂CID755673抑制。

3 讨 论

Lm是一种食源性病原体,摄入含有带菌的食品并通过胃肠道进入宿主是李斯特菌病暴发的原因[15]。真核细胞限制细菌感染可能是通过细胞自主防御、营养免疫和先天免疫反应(包括诱导程序性细胞死亡)的共同作用[16-17]。破坏宿主肠道屏障是Lm致病的关键机制[18]。Lm穿过肠道上皮屏障的主要途径有3条:李斯特菌粘附蛋白(listeria adhesion protein,LAP)介导的Lm易位、内化素A(internalin A,InlA)与E-钙粘蛋白(E-cadherin)结合介导的Lm转胞吞作用、M细胞(microfold cell)介导的Lm易位[11]。在Lm感染的早期(几个小时内),LAP介导途径发挥主要作用,协调复杂的细胞信号传导事件,激活调节分子NF-κB和肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK),打开上皮细胞间的连接,促进细菌易位[19]。与此同时,紧密连接的开放,增加E-cadherin的暴露,促进InlA进入E-cadherin及其易位。还有研究表明,在上皮细胞挤出、杯状细胞胞吐作用和细胞凋亡过程中,E-cadherin短暂地暴露于多细胞连接处的管腔表面,此时Lm利用连接重塑粘附并侵入上皮[10]。由此可见,在Lm的肠道感染阶段,炎症通路及细胞连接屏障的完整性对Lm的感染进程起重要作用。

PKD蛋白是炎症过程中的主要参与者,与许多疾病的发展紧密相关。PKD可以调节NF-κB、HSP27和COX-2的活性,肿瘤细胞、免疫细胞、肌成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞中促炎细胞因子和趋化因子的产生都需要PKD参与[9]。在一些感染性疾病中,病原体可诱导PKD的激活,并且PKD的激活对于病原菌介导的NF-κB的激活以及促炎介质的表达是必不可少的[20-21]。趋化因子和促炎介质的成熟和释放,是机体抵抗病原体感染的重要环节,因此PKD在机体抗感染中发挥重要作用。PKD是正常细胞中细胞周期G2-M和有丝分裂期的新型细胞周期调节因子,能通过NF-κB,ERK1/2,Akt和热休克蛋白90(HSP90)等信号传导途径抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞存活[9]。Wei N等报道了结肠癌细胞系中药理学抑制PKD或转染PKD2靶向siRNA能够抑制NF-κB活性,诱导细胞凋亡[22]。Xiong J等发现PKD2活性缺乏导致ZO-1和MUC2蛋白水平显著下降,紧密连接蛋白的缺陷可能导致上皮屏障功能障碍[23]。据此,PKD可能是维持上皮屏障功能的重要调节蛋白,本研究也获得同样的结果。

越来越多的研究表明,ERK1/2信号通路在激活炎症反应[24]和细胞抗凋亡[25]中发挥重要作用。本研究结果显示,Lm感染Caco-2细胞时,抑制PKD会抑制ERK1/2信号通路,降低细胞存活率,减少细胞炎症,这些可能会促进Lm感染进程。

综上所述,PKD在Lm感染Caco-2细胞过程中发挥重要作用。Lm感染促进Caco-2细胞表达PKD,Lm感染的Caco-2细胞通过PKD-ERK1/2信号通路调节细胞存活率和炎症,从而调控Lm感染。由于CID755673对3种PKD亚型均有抑制效果,后续需进一步研究PKD1、PKD2和PKD3在Lm穿越肠道屏障中的作用及其机制。

利益冲突：无