健脾捏脊疗法对厌食症模型大鼠作用机制研究*

黄学平,曹 蝶,任香颖

(昭通市中医医院,云南 昭通 657000)

小儿厌食症(infantileanorexia)多因喂养不当、乱投以杂食,或任其所好,养成偏食或进食不定时等习惯,可导致其脾失健运,胃不思纳,进而形成厌食症。本病主要特征表现为长期地食欲减退甚至消失、食量下降甚或厌恶进食。是儿科的常见病及多发病。此病在我国的发病率为约12%～34%[1]。研究证实,小儿厌食症与脑肠肽一食欲中枢”有密切关系。小儿厌食与外周或中枢脑肠肽分泌紊乱有关。而Ghrelin和npy是两种重要的胃饥饿素和酪神经肽,它们能够有效地影响人们的消化和吸收。我们在前期临床研究观察发现,健脾捏脊疗法可改善厌食症患儿临床症状,故为进一步探究健脾捏脊疗法治疗小儿厌食症作用机制是否与通过影响血浆、下丘脑组织中Ghrelin分泌释放调节有关,设计如下研究方案,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用健康SD幼龄大鼠,96只(雌雄各半),日龄40～45 d,体重(70±10)g,由昆明泉港生物科技有限公司供给。给以自然光照,常温饲养,饲料充足,饮水自由。

1.1.2 主要试剂及仪器 TRIzol.Reagent(Cat.no.15596-018,Life)、SureScript.First-StrandcDNASynthesisKit(QP056,GeneCopoeia)、Blaze Taq.SYBR.GreenqPCRMix 2.0(QP031,GeneCopoeia)、All-in-One.miRNA qRT-PCRDetectionKit2.0(QP010,GeneCopoeia)、All-in-One.First-StrandcDNASynthesisKit2.0(QP113,GeneCopoeia)、HomosapienssnRNAU6q PCRPrimer(HmiRQP9001,GeneCopoeia)、96孔半裙边PCR板(BSH08S1,BIOER)、光学封板膜(BSH14S1,BIOER)等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 大鼠适应性饲养1周后,采用随机数字表法将大鼠划分成4个小组:正常组、模型组、干预正常组、干预模型组,每个小组24只,共96只进行实验观察。除正常组和干预正常组,模型组、干预模型组据汪受传[2]按病因模拟方法建立厌食症动物模型的方法建立实验动物模型,造模成功标准[3]包括:食欲明显下降、体重增加变得缓慢、易发脾气、大便困难以及毛发枯糙的情况。造模后次日,进行相应干预治疗。

1.2.2 干预方法 干预模型组、干预正常组以健脾捏脊疗法进行干预,具体操作:取出幼鼠置于手掌心,掌指略有弯曲,以确保其适应掌中环境。待其适应环境后,首先分别予以补脾经、补肺经各300次,揉按板门、运内八卦各100次;其次,顺时针摩腹、揉运腹部3 min;最后捏脊3次。20 min/次/d,1周连续5次,休息2 d。予以正常饮食喂养,自由进水。模型组、正常组予以正常饮食喂养,自由进水,不予以任何治疗。

1.2.3 观察指标 (1)摄食量和体重:观察给药第7、14、21、28 d四个阶段的大鼠饮食饮食情况及体重的变化。(2)血浆Ghrelin:采用ELISA试剂盒对ghrelin的浓度进行检测。通过心脏穿刺抽出2mL的血,放入抗凝剂溶剂中溶解混匀,随后放入4℃的离心机内分离,取血测量Ghrelin水平。(3)下丘脑Ghrelin:同一时间内将实验大鼠处死,快速打开颅腔,将下丘脑取出置于液氮容器中,随后放入-80℃冰箱保存备用。大鼠新鲜下丘脑脑组织按照Trizol法制备RNA,1mLTrizol于5mL玻璃匀浆器中,再取脑组织放入匀浆器中,4℃,12000rpm,离心15min。根据酶联免疫试剂盒的指示,精确测量每个孔的吸光度,以确定样品的浓度。

2 结果

2.1 各组大鼠体重比较 与正常组比较干预模型组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,干预模型组、干预正常组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),结果见表1。

表1 各组动物体重变化

2.2 各组大鼠摄食量比较 与正常组比较,干预模型组大鼠摄食量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,干预模型组、干预正常组大鼠摄食量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),结果见表2。

表2 各组动物摄食量变化

2.3 各组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量比较 与正常组比较,模型组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量明显下降(P<0.05);干预正常组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,干预模型组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05),结果见表3。

表3 各组大鼠脑组织和血清样本Ghrelin含量比较

3 讨论

近年许多实验研究对小儿厌食症的发病机制,提出了不同的观点和看法。其中关于小儿厌食病因较为热点的是“脑肠肽一食欲中枢”观点的提出。外周或中枢脑肠肽分泌紊乱可对食欲中枢功能活动造成影响。本实验观察到,与正常组比较,模型组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量明显下降,干预正常组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量无明显变化。与模型组比较,干预模型组大鼠脑组织、血清中Ghrelin含量明显升高。表明健脾捏脊疗法可促进大鼠脑组织和血清中Ghrelin水平的提高。本实验中,与正常组比较,模型组、干预模型组大鼠体重、摄食量明显增加;与模型组比较,干预模型组、干预正常组大鼠体重明显增加,说明健脾捏脊疗法可改善厌食症患儿食欲,促进摄食量增加,进而增强体重。Ghrelin是一种内源性配体,它主要分布于胃肠道和下丘脑弓状核,它不仅能够促进生长素的释放,而且还能够提高食欲,增强体重,并且参与体重和能量的长期平衡[4]。ghrelin对食物摄入有重要影响,在空腹时,ghrelin浓度较高,可刺激食欲引起觅食行为。研究证实,Ghrelin作用于下丘脑弓状核NPY、AgRP神经元[5]可刺激摄食行为,ghrelin通过作用于下丘脑弓状核NPY/AgRP神经元的GHSR及作用于脑干DVC的GHS-R,然后通过上行纤维引起下丘脑NPYmRNA及AgRPmRNA的表达增加,且两条途径协同作用引起多食反应[6-7]。研究表明Ghrelin可以通过血脑屏障,推拿促进血清中Ghrelin水平的提高,Ghrelin通过血脑屏障作用于下丘脑食欲中枢的NPY和AGRP的神经元表达GHS-RmRNA[8]。

健脾捏脊疗法是基于厌食症患儿的病因病机、古代历代医家治疗本病的经验荟萃及长期的临床工作经验所总结。其主要推拿选穴为补脾经、补肺经、揉板门、运内八卦、摩腹、运腹、揉按足三里、捏脊及点按背部等腧穴。《小儿推拿方脉话婴秘旨全书》:“脾经有病食不进,推动脾土必效应”。故治疗脾系病症常选用脾经穴。《小儿推拿广意》中记载“板门,揉之除气吼肚胀”“揉板门穴,止小肠之寒气”。《小儿推拿秘旨》亦提到“板门专制气发攻”,表明板门治疗小儿乳食停积、食欲不振、腹胀等脾胃功能异常所致的消化系统疾病。捏脊是通过刺激督脉旁两侧足太阳膀胱经,膀胱经第一侧线上背腧穴皆对应人体五脏六腑,通过捏脊可调节人体脏腑气血。督脉为阳脉之海,与其相互交接,循环无端地运行气血维持人体的生命活动,故捏脊具有“调阴阳,理气血,和脏腑,通经络,培元气的作用。现代研究[9]认为,捏脊可促进急性胃运动过缓家兔动脉血浆内的Ghrelin水平恢复,捏脊调节胃肠功能的作用机制可能为通过改变神经肽类物质的浓度进而调节胃肠道的功能活动。捏脊治疗疾病的机理主要是通过提捏背部皮肤产生的刺激信息通过脑和脊髓的传导通路,对中枢神经和周围神经进行双向调节。

综上所述,本实验通过观察厌食症大鼠体重、摄食量及血清中和脑组织Ghrelin含量的变化,发现健脾捏脊疗法能改善厌食症模型大鼠的症状,其作用机制可能与调节血浆、下丘脑组织Ghrelin的分泌、释放有关。