基于4-CN沉淀法的食品H2O2可视化检测

＊杨文瑞 路迎雪 颜妍 陈彦博 薛慧 胡善文

（福建医科大学公共卫生学院 福建 350122）

H2O2是一种重要的氧化剂，广泛应用于食品加工、医药消毒、工业漂白等领域[1]。它能有效杀灭病原微生物，并可分解生成水与氧气，对环境影响很小。我国GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中允许在食品加工中使用H2O2作为加工助剂[2]。但是，过量的H2O2也会对人体健康和食品安全造成危害。H2O2作为活性氧自由基的重要前体之一，可诱导氧化应激，损伤细胞膜脂双层[3]、核酸和蛋白质[4]，残留在食物中的H2O2也可引发消化道疾病。因此，快速准确检测食品及生物样本中H2O2残留量，监控其在工业、医药及日常生活中的使用，对保护公共健康和食品安全非常必要。

当前对H2O2的分析方法主要有滴定法、分光光度法、电化学法、色谱法和比色传感法[5]等。例如Klassen,Normal V.等人[6]探讨和比较了碘离子法和高锰酸钾滴定法两种测定溶液中过H2O2浓度的方法。Qixin Liu等人[7]通过TMB-Fe3O4@AuNPs合成了一种以四甲基联苯胺氧化为显色反应的H2O2双传感器。这些方法灵敏度高，准确可靠，但对仪器要求高，操作复杂，不适用于现场快速筛查[8]。因此，亟需研发一种简便快速的H2O2检测方法，用于食品、医药等行业的现场监测。

沉淀法是一种简便经典的分析检测方法，利用发生沉淀反应产生的颜色变化实现可视化的定性或定量分析。本文旨在采用4-CN作为显色试剂，研究建立H2O2的快速检测方法。通过系统优化实验条件，考察反应机理，建立检测模式，并扩展至实际样品检测，为H2O2的快速监测提供一种新的可选途径。

1.试验部分

（1）试验试剂。试剂：30% H2O2、4-CN（纯度≥99%）、HRP、无水乙醇（纯度≥99.7%）、1mg/mL羧基化石墨烯量子点、磷酸缓冲液。所有的化学试剂通过上海麦克林生化科技有限公司购买的，无需进一步提纯就可以使用。

（2）试验仪器。多功能微孔板酶标仪（Infinite 200 PRO，Tecan）。

（3）实验原理。HRP含有血红素类的活性中心，可催化各种化合物的氧化还原反应。4-CN为HRP的一种典型底物，在HRP催化下，4-CN被H2O2氧化，生成一个自由基中间产物，该自由基迅速偶联形成不溶性的紫色聚合物。因此，溶液的颜色由无色变为紫色，颜色深浅和H2O2浓度呈正比。

（4）标准工作曲线的检测。本实验使用质量分数为30%的H2O2存储液，通过系数稀释的方法配制成12.5μM、25μM、50μM、75μM、100μM 5个不同浓度的H2O2溶液，再分别添加0.2mM 4-CN溶液和0.1mg/mL的HRP溶液，充分混匀后静置于室温条件下反应10min。显色结束后，在光学拍照箱中使用手机进行拍摄，图片使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0读取色度值。

（5）可视化试纸检测。利用羧基化石墨烯量子点和HRP修饰硝酸纤维素试纸步骤如下：取1mg/mL羧基化石墨烯量子点和0.1mg/mL的HRP溶液制备石墨烯-HRP混合液，超声处理使其充分吸附。取硝酸纤维素滤纸，裁剪成小片（1cm×5cm），将石墨烯-HRP混合液涂布在滤纸片上，自然晾干。加入等量的4-CN溶液后按上节所述完成检测，使用智能手机记录滤纸颜色。

（6）实际样品分析。取新鲜牛奶样品，配制一系列浓度分别为12.5μM、30μM、45μM、60μM、90μM的H2O2溶液，按上述步骤在纸上完成检测后拍照。

2.结果与讨论

（1）反应动力学和稳定性。启动反应后，使用多功能微孔板酶标仪测试混合液在540nm波长下的吸光度变化，如图1（a）、（b）所示。每60s记录一次吸光度值，连续测试35min，获取反应动力学曲线，如图1（c）。从结果曲线可以看出，前5min吸光度快速升高，5～10min吸光度缓慢升高，10min后基本达吸光平台期。这表明反应体系在前10min内“-C-H”基团被H2O2不断氧化生成着色产物，10min后反应基本完成。综合反应动力学规律，确定该体系的最佳反应时间为10min。另外对反应体系的稳定性进行考察，结果如图1（d）所示，在2h内色度值基本保持一致。实验结果表明，在给定反应时间内，该体系的RGB值变化很小，反应稳定，验证了方法的稳定性和可靠性，为后续样品分析奠定了基础。

图1 检测方法性能分析

（2）标准曲线。在最优条件下，按实验部分1.4的方法分别测定不同浓度的H2O2标准溶液，读取RGB数值对H2O2的浓度建立定量分析的标准曲线。使用图像分析软件读取各样品瓶中溶液的RGB色值，以蓝色色度值（色度值越低代表颜色越深）为计数依据，样品瓶检测结果如图2（a）、（c）、（e）所示。对标准溶液浓度与对应的RGB值进行线性拟合，如图2（b）所示，其呈现出良好的线性关系，线性方程为y=122.8-0.84x，R2=0.992，在优化条件下，该体系可检测到浓度最低达到5μM的H2O2标准溶液，如图2（d）所示。

图2 不同浓度H2O2在样品瓶中的显色结果与对应的RGB数值

（3）试纸性能检测。试纸上检测不同浓度H2O2结果如图3（a），读取的RGB数值如图3（b）所示。另外取新鲜牛奶样品进行测定，并与空白对照样品同时检测。结果显示，牛奶样品与空白对照样品的检测结果无明显差异，均未检出H2O2如图3（c），读取的RGB数值如图3（d）所示。为验证方法有效性，对牛奶样品进行标准溶液的加标回收实验。向牛奶样品中分别加入浓度已知的H2O2标准溶液，测定加标样本中的H2O2含量如图3（e），读取的RGB数值如图3（f）所示。将检测值与加标量进行比较，计算加标回收率在90.0%～105.0%之间如表1所示。表明在食品样本中，该方法可以准确检测H2O2。

表1 牛奶样品加标回收率计算结果

图3 方法检测性能表征结果

3.结论

（1）方法检验性能及实际样品检测。标准曲线结果显示，在12.5～100μmol/L的范围内，该沉淀反应的色度与H2O2浓度呈现良好的线性关系（R2＞0.99），因此可用于建立的半定量检测模型。重复性实验结果显示，在最佳反应条件下，同一浓度样品的RGB数值相对标准偏差小于5%，说明方法具有良好的重现性。动力学研究发现，随反应时间延长，样品颜色逐渐加深，吸光值持续增加，约5min达到稳定值。样品稳定性研究表明，色度稳定后，2h内变化不大。

（2）根据以上参数制作的H2O2可视化检测试纸，可以有效完成对标准溶液、牛奶样品、加标牛奶样品的H2O2检测。本实验中，在牛奶样品中未检测到H2O2残留，对加标样品均有明显的显色反应，加标回收实验中回收率在90.0%～105.0%范围内，表明该方法可以用于食品中H2O2可视化快速检测。对于其他颜色的样品，可以采用对照线对比的方式扣除基质颜色干扰。

（3）本研究采用的4-CN沉淀法具有操作简便、快速、试剂易得等优点，可在短时间内指示样品中H2O2的大致含量，尤其适用于高浓度H2O2的快速筛查。但作为一种半定量分析手段，该方法检测结果的准确性还需要其他标准定量方法如电化学、色谱等进行验证。另外该法灵敏度有限，仅适用于高浓度样品快速检测，对低浓度H2O2检测灵敏度有待提高。因此，建议该方法作为一种快速现场预筛工具，与其他标准定量分析方法联用，发挥各自的优势，以获得准确可靠的H2O2定量结果。本研究为快速检测食品样品中H2O2残留提供了一种简便有效的方法，具有一定的应用前景和推广价值。