卵巢低反应女性中沉默信息调节因子1对卵巢颗粒细胞的调控

柯慧 颜礼征 张宇 毛记龙 姚宇飞

海南医学院第一附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室，海南医学院第一附属医院生殖医学科，海南医学院第一附属医院海南省地方病（地中海贫血）临床医学研究中心，海南医学院生殖健康与相关疾病研究与转化教育部重点实验室，海南医学院第一附属医院海口市人类遗传资源保藏重点实验室（海口 570102）

卵巢低反应（poor ovarian response，POR）是卵巢对促性腺激素反应不良的病理状态，主要表现为促排卵周期发育的卵泡数量少、雌激素峰值低、促性腺激素用量多、周期取消率高、获卵数少及妊娠率低。卵巢颗粒细胞对卵母细胞和胚胎的发育具有重要作用。颗粒细胞的增殖和凋亡调控卵泡的发育和闭锁，此外，颗粒细胞的增殖和凋亡受到多种细胞因子和蛋白的调控［1］。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是调节细胞凋亡的抑制因子，通过调控多种代谢、内分泌信号转录因子，去乙酰化调节多个基因转录和细胞凋亡［2］。SIRT1可抑制动物始基卵泡发育的启动，减少始基卵泡向初级卵泡转化并抑制始基卵泡凋亡，有助于保留卵巢储备功能，并且可以通过调控动物颗粒细胞凋亡和类固醇激素合成关键酶的表达，进而影响卵母细胞数量和质量。然而，目前这些研究大多数为动物实验，SIRT1是否调控POR女性的卵巢颗粒细胞，影响卵子数量和质量，进而导致女性不孕仍未得到证实。

因此，探索SIRT1在POR发生中的分子机制，有助于发现POR新的病因，有利于寻找新的诊断和治疗策略，解决临床治疗中的难题。

白藜芦醇（resveratrol，RESV）是目前活性最强的特异性SIRT1激动剂，主要作用机制为RESV增加SIRT1对NAD+和乙酰化底物的亲和力，增强乙酰化底物的去乙酰化，从而增强SIRT1活性［3-6］。EX527是目前活性最强的特异性吲哚类SIRT1抑制剂，主要作用机制为NAD+脱离后，EX527快速与SIRT1结合，抑制去乙酰化底物的解离，有效抑制SIRT1的去乙酰化酶活性［7-10］。因此，本研究分别选择RESV和EX527作为SIRT1的特异性激活剂和抑制剂。

1 资料与方法

1.1 研究对象本研究纳入2021年10月至2022年3月于海南医学院第一附属医院生殖医学科行IVF/ICSI-ET助孕的女性共60例，其中卵巢低反应（POR）组和卵巢正常反应（normal ovarian response，NOR）组各30例，两组女性年龄均分别一致。本课题已获得本院伦理委员会批准［批件号：2021（科研）第（86）号］，所有纳入女性均已签署书面的知情同意书。POR组和NOR组女性的基本情况见表1。

表1 POR组和NOR组女性的基本情况Tab.1 Characteristics of females in POR group and NOR group ±s

表1 POR组和NOR组女性的基本情况Tab.1 Characteristics of females in POR group and NOR group ±s

注：HCG示人绒毛膜促性腺激素；E2示雌二醇

项目年龄（岁）体质量指数（kg/m2）HCG日E2水平（pmol/L）获卵数P值-0.258＜0.001＜0.001 POR组32.26 ± 1.87 20.66 ± 0.89 2 370 ± 539 2.73 ± 0.45 NOR组32.26 ± 1.87 20.36 ± 1.11 11 502 ± 2 527 10.33 ± 1.88 t值-1.143-19.352-21.517

1.2 POR组纳入和排除标准纳入标准：（1）年龄20～35岁；（2）窦卵泡数（antral follicle count，AFC） ≤ 5个或抗苗勒管激素（anti-Müllerian Hor-mone，AMH）＜1.1 ng/mL；（3）常规促排卵方案获卵数≤ 3个。排除标准：患有内分泌疾病。

1.3 NOR组纳入和排除标准纳入标准：（1）年龄20～35岁；（2）AFC 7～15个并且AMH 1.1～3.5 ng/mL；（3）月经规律，周期25～35 d；（4）获卵数7～15个。排除标准：患有内分泌疾病。

1.4 促排卵方案本研究纳入的均为常规促排卵方案，NOR组均采用长方案、POR组均采用拮抗剂方案。当至少2个卵泡直径达到18 mm时，给予人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）注射。注射后36 h在阴道超声引导下行经阴道穿刺取卵，并收集捡卵后剩余的卵泡液。

1.5 卵巢颗粒细胞培养和收集采用密度梯度离心法分离纯化卵泡液中的颗粒细胞。收集捡卵后剩余卵泡液，室温200 ×g，离心5 min。弃上清后加入含有0.2%透明质酸酶的PBS，室温消化30 min。将细胞悬液缓缓铺在细胞分离液Ficoll -Paque表面，室温150 ×g，离心20 min，吸取中间的白色颗粒细胞层，PBS洗涤。加入含有10%牛血清的DMEM/F12培养基，颗粒细胞体外培养24 h后换液，去除未贴壁的颗粒细胞和血细胞［11］。

分别加入含100 μmol/L RESV或EX527的培养基，继续培养48 h后使用胰酶消化细胞，收集颗粒细胞。由于RESV和EX527粉末均选用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配置，因此对照组的培养液中同样加入与药物组等量的DMSO。

1.6 主要试剂和仪器DMEM/F12基础培养基、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清购自Gibco公司，RESV和EX527、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）购自Sigma公司，淋巴细胞分离液（FicollPaque PREMIUM）购自Pharmacia公司，Trizol购自Ambion公司，反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自Takara公司，所有qPCR引物均由金唯智生物科技有限公司合成。蛋白Marker购自Thermo公司，抗体购自Abcam公司，增强化学发光法（ECL）试剂购自美国Millipore公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，雌二醇测定试剂盒（化学发光法）购自美国Beckman公司。

CO2培养箱购自SANYO公司，离心机和PCR仪（反转录）购自Eppendorf公司，酶标仪购自美国宝特公司，SDS-PAGE垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司，核酸蛋白质分析仪购自美国Beckman公司，蛋白质浓缩仪购自德国Eppendorf公司，凝胶成像仪购自美国GE公司，荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.7 qPCR检测mRNA水平颗粒细胞样品中加入Trizol提取RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，依照qPCR试剂盒使用说明书分别检测SIRT1、StAR、CYP19、CYP17、β-actin基因的mRNA水平，每例样本设置3个复孔。检测基因的引物序列见表2。采用2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平的差异。

1.8 Western blot检测蛋白水平将颗粒细胞裂解液离心后收集上清液，测定蛋白浓度。将蛋白进行凝胶电泳，80 V电泳50 min，120 V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。取出凝胶，100 V恒压60～120 min转膜。室温下封闭1 h或4 ℃过夜，加入一抗稀释液，4 ℃过夜或37 ℃孵育2 h，充分洗涤后，加入相应的二抗稀释液，37 ℃孵育1 h，充分洗涤后，将化学荧光发光底物均匀加到膜的表面，放至暗盒，显影。扫描图像，用Image J图像分析系统分析蛋白条灰度值。以GAPDH作为内参。

1.9 TUNEL法检测颗粒细胞凋亡率于4孔板中培养颗粒细胞，用PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤1次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5 min。PBS洗涤后加入TUNEL检测液，37 ℃避光孵育1 h。孵育结束后再用PBS洗涤3次，加入适量DAPI染色液，室温放置5 min，洗涤后在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.10 化学发光法检测培养液中雌二醇水平收集卵巢颗粒细胞体外培养液1 mL。采用雌二醇测定试剂盒（化学发光法）处理培养液，检测培养液中雌二醇水平。

1.11 统计学方法采用 SPSS 22.0 软件进行分析，计量资料表示为均数±标准差，两组样本间的比较采用两独立样本t检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 POR女性颗粒细胞SIRT1表达将卵巢颗粒细胞进行分离纯化后进行检测，POR组和NOR组各检测30例。qPCR结果表明POR组颗粒细胞SIRT1 mRNA水平显著低于NOR组（图1）。Western blotting结果同样表明POR组SIRT1蛋白水平显著低于NOR组（图2）。

图1 颗粒细胞中SIRT1 mRNA的表达水平Fig.1 The expression level of SIRT1 mRNA in granulosa cell

图2 颗粒细胞中SIRT1蛋白的表达水平Fig.2 The expression level of SIRT1 protein in granulosa cell

2.2 RESV和EX527对POR女性颗粒细胞SIRT1表达的影响使用RESV或EX527分别处理30例POR组颗粒细胞，作用48 h后收集细胞，对照组为不使用药物处理的颗粒细胞。qPCR结果表明RESV显著上调颗粒细胞SIRT1 mRNA水平，EX527显著下调SIRT1 mRNA水平（图3）。Western blot结果同样表明RESV显著上调SIRT1蛋白水平，EX527显著下调SIRT1蛋白水平（图4）。

图3 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞SIRT1 mRNA的表达水平Fig.3 The expression level of SIRT1 mRNA to POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图4 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞SIRT1蛋白的表达水平Fig.4 The expression level of SIRT1 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.3 RESV和EX527对颗粒细胞类固醇激素合成关键酶表达的影响使用RESV或EX527分别处理30例POR组颗粒细胞，作用48 h后收集细胞，对照组为不使用药物处理的颗粒细胞。qPCR结果表明RESV显著上调颗粒细胞中类固醇激素合成关键酶（StAR、CYP19、CYP17）mRNA水平，EX527显著下调类固醇激素合成关键酶mRNA水平（图5-7）。Western blot结果同样表明RESV显著上调类固醇激素合成关键酶蛋白水平，EX527显著下调类固醇激素合成关键酶蛋白水平（图8-10）。

图5 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞StAR mRNA的表达水平Fig.5 The expression level of StAR mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图6 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞CYP19 mRNA的表达水平Fig.6 The expression level of CYP19 mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图7 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞CYP17 mRNA的表达水平Fig.7 The expression level of CYP17 mRNA in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图8 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞StAR蛋白的表达水平Fig.8 The expression level of StAR protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图9 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞CYP19蛋白的表达水平Fig.9 The expression level of CYP19 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图10 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞CYP17蛋白的表达水平Fig.10 The expression level of CYP17 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.4 RESV和EX527影响SIRT1对POR女性颗粒细胞凋亡的调控使用RESV或EX527分别处理30例POR组颗粒细胞，作用48 h后收集细胞，对照组为不使用药物处理的颗粒细胞。采用TUNEL法检测颗粒细胞凋亡率，细胞核用DAPI染色（蓝色），TUNEL阳性细胞为凋亡细胞，细胞核被染成绿色。细胞凋亡率为平均每个视野中TUNEL染色阳性细胞核数占细胞核总数的百分比。在每例样本中随机选取3个视野进行计数，取平均值。此外，采用Western blot检测颗粒细胞中抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Caspase-3水平。结果表明使用RESV处理后，颗粒细胞凋亡率显著降低，Bcl-2蛋白水平显著上升，Caspase-3蛋白水平显著下降；使用EX527处理后，颗粒细胞凋亡率显著升高，Bcl-2蛋白水平显著下降，Caspase-3蛋白水平显著上升（图11-14）。

图11 TUNEL法检测白藜芦醇组、对照组、EX527组颗粒细胞的凋亡情况（× 100）Fig.11 Granulosa cell appotosis in RESV group，control group and EX527 group was detected by TUNEL method（× 100）

图12 TUNEL法检测白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞的凋亡率Fig.12 The apoptotic rate of granulosa cells in ROR female treated with 48 h resveratrol or EX527 was detected by TUNEL method

图13 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达水平Fig.13 The expression level of Bcl-2 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

图14 白藜芦醇或EX527处理48 h后POR女性颗粒细胞Caspase-3蛋白的表达水平Fig.14 The expression level of Caspase-3 protein in POR female granulosa cell treated with 48 h resveratrol or EX527

2.5 RESV和EX527影响POR女性颗粒细胞合成雌二醇使用RESV或EX527分别处理30例POR组颗粒细胞，作用48h后收集细胞培养液，对照组为不使用药物处理的颗粒细胞培养液。检测颗粒细胞体外培养液中雌二醇水平。化学发光法检测结果显示使用RESV作用后培养液中雌二醇水平显著增加，使用EX527作用后培养液中雌二醇水平显著下降（图15）。

3 讨论

不孕症的发病率在逐年升高，当前不孕症的全球发病率为15%～20%。不孕症将成为继心血管疾病、肿瘤之后危害人类健康的第三大疾病。自辅助生育技术逐渐开展至今，POR是生殖科的常见病，研究［12］发现促排卵周期中9%～24%女性会发生POR，而＞40岁的妇女中POR的发生率约为50%。本研究也表明年龄≥ 40岁且AFC＜5的患者在首次促排卵IVF/ICSI周期中POR的发生率为98.7%［13］，而POR患者的年龄是预测IVF/ICSI-ET周期临床妊娠的最佳指标［14］。POR会导致获卵数减少、卵子成熟率、受精率、卵裂率、囊胚形成率、优质胚胎率均较低，促排卵周期取消率增高，可移植胚胎数减少，胚胎着床率下降，导致患者不能获得妊娠。POR是困扰生殖医学科临床医生的重大难题之一。

SIRT1是NAD + （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）依赖的蛋白去乙酰酶，位于人类染色体10q21.3，是细胞进行自我保护的重要分子之一，具有高度保守性。SIRT1主要从能量代谢、氧化应激、基因调控等方面抑制细胞的凋亡。此外，SIRT1通过调控炎症状态从而延缓细胞衰老，通过某些关键因子调控细胞周期及机体代谢，如抑制凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Caspase-3、FOXO、P53、核因子NF-κB、过氧化物酶体增殖物受体协同刺激因子la（PGCL-a）、KUTO以及转录因子E2F1。SIRT1也参与调控卵巢功能，雷帕霉素及其靶向因子（mammalian target of rapamycin，mTOR）通过调节SIRT1，起到抑制卵泡发育的作用，从而保留小鼠的卵巢储备功能［15-16］。SIRT1的减少会加速卵母细胞老化［17］。

卵泡的发育过程中颗粒细胞的不断分化。颗粒细胞围绕在卵母细胞周围，与卵母细胞关系密切，颗粒细胞能够调节卵泡发育和凋亡的过程，从而影响卵母细胞的质量［18］。颗粒细胞包裹着卵泡构成微环境，其将营养物质、生长因子等运输至卵母细胞，为卵母细胞的发育提供能量。此外，颗粒细胞通过贮存和释放分子信号以激活始基卵泡、选择优势卵泡及调控卵母细胞成熟。本研究发现POR女性卵巢颗粒细胞中SIRT1的mRNA和蛋白表达水平显著低于NOR女性。同样有研究［19］表明POR女性的颗粒细胞SIRT1蛋白水平显著低于NOR女性（每组仅有7例）。

RESV是最早被发现的SIRT1激动剂，是一种从红葡萄皮、酒和花生中发现的植物类抗毒素。RESV具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和维持能量平衡等多种生物学功能［20-23］，其中抗氧化作用对人体维持正常状态、延缓多种疾病、生殖系统疾病至关重要［24］。此外，RESV能够改善促性腺激素浓度、优质卵母细胞率和优质胚胎率［25］。RESV能竞争性抑制降解cAMP的磷酸二酯酶的活性，导致细胞内cAMP水平升高，激活cAMP的效应蛋白Epac1，使细胞内Ca2+水平升高，从而通过磷脂酶C和兰尼碱受体的钙释放通道激活CaMKKβ-AMPK途径，导致NAD+水平增加，增强SIRT1的活性，起到延缓衰老的作用［26］。RESV可促进SIRT1表达水平增加，并且呈剂量依赖性［27］。IVF助孕的女性中，RESV能够促进卵巢颗粒细胞中SIRT1的表达，SIRT1减少过氧化氢诱导的氧化损伤，从而保护黄素化颗粒细胞［28］。本研究同样表明RESV能够促进POR女性卵巢颗粒细胞中SIRT1的表达。

本研究发现RESV通过增加POR女性颗粒细胞中SIRT1的表达，从而增加颗粒细胞中类固醇激素合成关键酶（StAR、CYP19、CYP17）的表达。类固醇激素包括雌激素、孕激素和雄激素等，其合成需要多种酶的参与，发挥关键作用的酶有类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）、芳香化酶（CYP19）、17α-羟化酶（CYP17）等。StAR主要位于线粒体膜上，促进转运类固醇激素合成的基本原料胆固醇。CYP19、CYP17均为P450家族。SIRT1参与调控类固醇激素合成关键酶的表达。SIRT1可增加乳腺癌相关基因CYP19表达，抑制SIRT1表达导致促进CYP19的转录因子ERa乙酰化增强，从而抑制CYP19的表达［29］。RESV促进女性黄素化颗粒细胞SIRT1、StAR和P450arom的表达［30］。

抑制SIRT1表达会增加大鼠颗粒细胞凋亡，导致卵巢储备功能下降［31］，相反，激活SIRT1可抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡［32］。SIRT1调控细胞凋亡的机制相当复杂，通过Bcl-2家族发挥作用可能是其通路之一。抑制凋亡蛋白Bcl-2参与调控线粒体凋亡，抑制细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡［33］。抑制miR-138-5p之后，其靶基因之一SIRT1mRNA表达增加，Bcl-2表达增加，从而抑制鸡的颗粒细胞凋亡［34］。H2O2诱导的氧化应激通过抑制SIRT1，上调p53活性，引起颗粒细胞COV434凋亡［35-36］。RESV通过SIRT1/Nrf2/ARE信号通路减少氧化应激，防止H2O2诱导的大鼠卵巢黄素化颗粒细胞损伤和凋亡［37］。通过激活AMPK/SIRT1信号通路可以抑制大鼠肝细胞凋亡［38］。RESV可促进脊髓损伤大鼠组织中SIRT1、P-AMPK、Bcl-1、Bcl-2、Bcl-3的表达，而抑制Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达，通过SIRT1/AMPK通路抑制细胞凋亡［39］。IVF助孕的女性中，RESV能够促进卵巢颗粒细胞中抑制凋亡蛋白的表达，而抑制促凋亡Caspase-3蛋白的表达［28，40］。SIRT1通过激活ERK通路和抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，从而抑制颗粒细胞凋亡，并且颗粒细胞中SIRT1促进Bcl-2的表达，抑制Caspase-3的表达［19］。这与本研究结果是一致的。因此，RESV可能成为改善POR女性的卵巢反应性，增加获卵数的治疗药物。

本研究发现SIRT1能够促进POR女性卵巢颗粒细胞中雌二醇的合成。超促排卵最终需要扳机，注射HCG后会引起颗粒细胞发生黄素化，孕酮浓度明显升高。因此，本研究中仅测定培养液中雌二醇水平，未测定孕酮水平。SIRT1调控雌激素的合成，雌激素对卵泡发育、颗粒细胞生长和增殖有重要影响。小鼠敲除SIRT1基因后，雌激素受体α（ERα）表达降低，ERα调控的雌激素相关基因表达降低，导致雌激素分泌减少［41］。SIRT1通过FOXO1来调控卵巢颗粒细胞中雌激素的分泌［42］。通过SIRT1/Nrf2/ARE信号通路可以调控大鼠卵巢黄素化颗粒细胞中雌激素的分泌［38］。

综上所述，POR女性卵巢颗粒细胞SIRT1水平低于NOR女性。POR女性中，SIRT1激活剂RESV上调颗粒细胞SIRT1水平。SIRT1抑制颗粒细胞凋亡，增加颗粒细胞中类固醇激素合成关键酶水平，从而促进颗粒细胞合成雌二醇。因此，SIRT1激活剂如RESV可能成为改善POR女性卵巢反应性，增加获卵数的治疗药物。