酶催化法测定13C 标记尿素同位素丰度

雷 雯， 解 龙， 宋明鸣

（上海化工研究院有限公司 上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台, 上海 200062）

尿素-13C 是尿素[13C]呼气试验诊断试剂的有效成份，被广泛应用于临床诊断幽门螺杆菌（helicobacter pylori, Hp）感染[1-2]，Hp 是目前已知胃中唯一存活的微生物，当患者口服尿素-13C 药物后，胃中的Hp 含有人类细胞中不存在的高活性脲酶，在胃酸存在下可以将尿素-13C 分解成13CO2，13CO2被小肠上段吸收后进入血液循环，到达肺部随呼气排出[3-4]。使用专业的质谱仪或13C 红外光谱仪分析服药前后呼气样本，当基线差值（delta over baseline，DOB）≥4 可判定为阳性[5-7]，即患者感染Hp，该方法因具有特异性高、无损伤、无放射性、快速等优势被公认为胃部感染Hp 诊断的金标准[8-9]。呼气试验诊断试剂及原料药尿素-13C 中同位素丰度的准确测定直接影响到临床检测结果，因此准确测定尿素-13C 的同位素丰度显得尤为重要。

现有尿素-13C 同位素丰度检测方法主要有液相色谱串联质谱法[10]、气相色谱串联质谱法[11]、傅立叶变换-离子回旋共振质谱法[12]和气体同位素质谱法[13]等。尿素-13C 原料药同位素丰度检测标准主要有美国药典方法和行业标准方法[14]，美国药典方法采用气相色谱串联质谱法，早期的2014 版美国药典[15]方法中无需衍生化处理，直接测定尿素-13C 的同位素丰度，但现行2022 版的美国药典方法[16]中采用衍生化的方法，衍生化步骤相对繁琐。行业标准方法的原理是利用亚硝酸具有强氧化性[13]，将尿素-13C 氧化生成13CO2，但在反应过程中亚硝酸易分解生成NO2等杂质气体，同时该方法也不具有选择性。市场上尿素[13C]呼气试验诊断试剂主要分为2 类：①胶囊，尿素-13C 为纯物质；②试剂盒，试剂盒中除了尿素-13C 外，还有辅料甘露醇、阿司帕坦、枸橼酸等物质[17]，试剂盒中的辅料绝对不能添加食品级的碳酸盐，因为碳酸盐在胃酸中反应生成CO2，对测试结果进行干扰，针对不同类型尿素[13C]呼气试验诊断试剂，现有的检测技术均无法模拟“胃”中的反应过程，因此开发一种既可以模拟“胃”中的反应过程，又快速的、专一性测试结果准确的尿素-13C 同位素丰度检测方法显得尤为重要。

胃中存在的Hp 含有人类细胞中不存在的高活性脲酶，在胃酸存在下可以将尿素-13C 分解成13CO2。脲酶是一种含镍的寡聚酶，高活性的非氧化还原金属酶，将尿素催化转化生成碳酸铵，酸性条件下分解产生二氧化碳。脲酶也被认为是目前已知的催化效率最高的水解酶[18]。脲酶分解尿素的方法在其它领域应用相对比较成熟[19-21]，但用于呼气试验诊断试剂及原料药尿素-13C 的测定却未见文献报道。本研究主要对酶活性的最佳温度、最优的反应时间和脲酶用量等参数进行了优化，并就酶催化法与行业标准方法测定13C 同位素丰度的结果、方法精密度、准确度等进行了对比，初步建立了基于酶催化法测定尿素-13C 同位素丰度检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

MAT-271 气体同位素质谱仪（美国Finnigan质谱公司）；DF-101Z 智能集热式恒温磁力搅拌器（上海卫凯仪器设备有限公司）；ML204T 电子天平（梅特勒托利多科技（中国）有限公司）。

尿素-13C（99.25%13C（原子百分比，下同），上海化工研究院有限公司）；标样尿素-13C（≥99.0%13C，3 个批号：I0H205、I1H205 和R081Q0，USP 参考标准）；尿素-13C（99.4%13C，批号：U822503，多伦多化学研究公司）；浓硫酸（AR，江苏强盛化工有限公司）；脲酶（～1 U/mg，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）；尿素（AR，天然丰度1.11%13C）、甘露醇（AR）、亚硝酸钠（AR），均为国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件

电子轰击（electron impact，EI）离子源；离子源温度130 ℃；电子能量100 eV；法拉第杯；高压10 kV；质量扫描30～50 m/z。

1.2.2 酶催化法转化原理

酶具有专一性，尿素-13C 在脲酶水溶液的存在下催化转化生成碳酸铵-13C，碳酸铵-13C 在酸性条件下分解产生13CO2，将13CO2气体引入MAT-271气体同位素质谱仪中检测质荷比为44 和45 离子流强度，并计算13C 同位素丰度。

1.2.313C 同位素丰度计算公式

CO2质荷比为44，13CO2质荷比为45，将反应生成的13CO2气体引入到MAT-271 气体同位素质谱仪中，检测质荷比为44 和45 的离子流强度，利用行业标准方法[14]计算13C 同位素丰度：

式中，E、I44、I45分别表示待测物质13C 同位素丰度、质荷比为44 的离子流强度和质荷比为45 的离子流强度。

1.2.4 样品前处理

图1、2 分别为进样旋塞阀和三球反应管的示意图。取3～10 mg 尿素-13C、50 mg 脲酶加入三球反应管中的“A”位置或“B”位置，取1～2 mL 蒸馏水放入三球反应管中的“A”位置，取0.5～1 mL，3 mol/L 硫酸溶液放入三球反应管中的“C”位置，进样旋塞阀“4”与三球反应管“5”连接，进样旋塞阀“1”与真空系统连接，打开旋塞阀“2”和“3”，抽真空。待液体中无气泡，此时可将进样旋塞阀中的旋塞阀“2”和“3”关闭，将三球反应管和进样旋塞阀从真空系统中取下，先将“A”中的蒸馏水倒入“B”球泡中，3～5 min 后再将“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中混合后生成13C 标记二氧化碳气体即可作为测定13C 同位素丰度的样品气。玻璃连接处均涂抹高真空硅脂。

图1 进样旋塞阀Fig.1 Injection stopcock

图2 三球反应管Fig.2 Three ball reaction tube

在对仪器做好必要的校正设置后，进样旋塞阀“1”接入气体同位素质谱仪，将三球反应管的球泡浸入酒精液氮调制的冷冻液中数分钟，利用气体同位素质谱仪的进样系统抽真空，待真空度低于50 Pa 后，打开旋塞阀“2”和“3”，将三球反应管内的13CO2引入气体同位素质谱仪中，检测质荷比为44和45 的离子流强度，通过式（1）计算13C 同位素丰度。

2 结果与讨论

2.1 反应温度的考察

酶催化反应的3 大特点为：专一性、温和性和高效性。酶的温和性是指酶催化反应需要在相对温和的条件下进行，适宜pH 和温度，尿素-13C 与脲酶的水溶液pH 接近7.0，脲酶活性最佳pH 为7.4，pH 在适宜的范围内。“A”球泡中的蒸馏水在抽真空时会出现温度降低的现象，温度低至10 ℃，此温度下酶的活性不足，反应温度过高又会造成酶失活，选择适宜的反应温度对准确测定13C 同位素丰度至关重要。三球反应管浸泡在相应温度的烧杯中，反应5 min，检测质荷比为45 的离子流强度，将反应温度为40 ℃的离子流强度设置为100%，其余反应温度的相对强度见表1，随着反应温度的增加，相对强度逐渐增加，在40 ℃时达到最大，之后下降，在20～60 ℃时，13C 同位素丰度无显著性差异，反应温度选择40 ℃。在10 ℃下酶的活性不足，生成的13CO2气体较少，13C 同位素丰度偏低。

表1 不同反应温度下的13C 同位素丰度Tab.1 13C isotopic abundances at different reaction temperatures

2.2 反应时间的考察

尽管酶的催化效率比无机催化剂更高，但不如酸碱滴定反应速度快，因此选择合适的反应时间是准确测定13C 同位素丰度的关键。尿素-13C 于40 ℃下，使用过量的50 mg 脲酶能在1 h 内完全分解3～10 mg 尿素-13C，脲酶的最佳pH 为7.4，在“1.2.4 样品前处理”过程中将三球反应管“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中混合，此时“B”球泡中的溶液呈酸性，脲酶失活，酶催化反应结束。反应时间是指“A”中的蒸馏水倒入“B”球泡中开始，一直到“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中结束。

检测质荷比为45 的离子流强度，将反应时间为60 min 的离子流强度设置为100%，其余反应时间的相对强度见表2，反应时间为1 min 时生成的13CO2气体较少，13C 同位素丰度偏低，反应时间为60 min 时13C 同位素丰度下降，可能是由于反应时间过长，进样旋塞阀“4”与三球反应管“5”的连接处有少量空气进去。由表2 可知，酶催化反应在20 min 内完全反应，在3～5 min 反应时间下检测13C同位素丰度与完全反应时测试的结果一致，为了缩短反应时间，反应时间优选3～5 min。

表2 不同反应时间下的13C 同位素丰度Tab.2 13C isotopic abundance at different reaction times

在无样品的空白进样实验中发现，由于玻璃连接处均涂抹高真空硅脂，在30 min 内无空气漏入，40 min 时有少量空气漏入，漏入空气的量约占实际样品气量的0.1%，空气中二氧化碳所占的比例为0.03%，二氧化碳的漏入比例非常少，可以忽略不计。尿素-13C 样品实际检测过程中整体耗时＜15 min，因此玻璃连接处无需做进一步处理。如果“C”中的硫酸溶液加入过多，在抽真空的时候会有少量溅出，通过管壁流入“B”球泡中，后续的酶催化反应终止，这一现象不易察觉，仪器进样后才能发现没有气体生成，在硫酸溶液中加入少量的甲基红指示剂可以让这种“终止反应”被轻易察觉，在反应没有结束时，“B”球泡中不会有甲基红指示剂的颜色。

2.3 脲酶用量的考察

在三球反应管“A”位置分别取10、25、50、75、100 mg 的脲酶和1 mL 蒸馏水，取100 μL 30 mg/mL 尿素-13C（标示值99.4%13C）加入三球反应管“B”位置，1 mL、3 mol/L 硫酸溶液加入三球反应管“C”位置，在pH 为7.0、40 ℃温度下，反应3 min，检测质荷比为45 的离子流强度，将脲酶用量为100 mg 的离子流强度设置为100%，其余脲酶用量的相对强度见表3。数据表明，随着脲酶用量的增加相对强度逐渐增加，在10 mg 脲酶催化反应下，最终生成的13C 标记二氧化碳较少，仅为仪器进样需求的1/4，13C 同位素丰度受质谱本底影响偏低，脲酶用量超过25 mg 时，反应气量均达到仪器进样需求，同时测试结果与标示值99.4%13C 基本一致，脲酶用量的增加可以进一步缩短反应时间，因此脲酶用量优选50 mg。

表3 不同脲酶用量下的13C 同位素丰度Tab.3 13C isotopic abundance under different urease dosages

2.4 方法精密度和准确度考察

使用自然丰度尿素与USP（R081Q0）进行1:1配制成同位素丰度为50.06%13C 的试样，采用1.2.4 节中方式，对不同厂家的尿素-13C 进行同位素丰度检测，各平行测样6 次，结果见表4。RSD 均＜0.1%，表明方法精密度良好。USP 3 个批次的尿素-13C 测试值平均值与标识值误差在0.05%13C 范围内，USP（I0H205）测试结果与文献[11]报道值99.0%13C 偏差为0.04%13C，TRC 的尿素-13C 测试平均值与标识值误差为0.02%13C，1:1 配制的尿素-13C 测试平均值与理论值误差为0.04%13C，表4 数据显示测定值与标样的标示值误差均在0.1%13C以内，表明方法准确度较高。

表4 精密度和准确度考察Tab.4 Precision and accuracy investigations

2.5 不同检测方法测定结果比对

同一样品分别采用酶催化法与行业标准法测定结果比对，各平行测样6 次。行业标准法的原理是尿素-13C 样品与亚硝酸钠试剂在硫酸的条件下反应生成13CO2气体，将生成的13CO2气体送入质谱仪检测系统，用质谱测定其13C 同位素丰度，结果见表5。2 种检测方法的精密度均＜0.1%，表明2种方法精密度较好，且13C 同位素丰度无显著性差异。行业标准法采用亚硝酸钠与硫酸作用生成亚硝酸，利用生成的亚硝酸具有强氧化性，将尿素-13C 氧化生成13CO2，在反应过程中亚硝酸易分解生成NO2等杂质气体，而酶催化法利用脲酶的专一性，只分解尿素-13C，整个反应无杂质气体生成，因此，酶催化法相对行业标准法具有很大的优势。

表5 酶催化法与行业标准方法测定结果比对Tab.5 Comparison of determination results between enzymatic catalysis method and line standard method

2.6 实际样品检测

酶促反应对底物有一定的选择性，所催化的反应通常也仅限于一种特定类型，生成特定的产物，这种现象称为酶的特异性。酶的特异性是指酶对催化底物的选择性。尿素、原料药尿素-13C、胶囊等均属于纯物质，尿素[13C]呼气试验诊断试剂盒是混合物，其中含有大量辅料甘露醇、阿司帕坦、枸橼酸等物质。辅料的添加对结果是否有影响，在pH 为7.0、40 ℃、反应时间为5 min 的条件下，考察了辅料甘露醇的影响。表6 中尿素-13C 化学试剂同位素丰度测试结果为99.15%13C，尿素-13C 化学试剂与甘露醇质量比为1:5 时同位素丰度测试结果为99.13%13C，两者相差-0.02%13C，表明辅料甘露醇对尿素-13C 同位素丰度的结果没有显著性影响，进一步表明方法选择性较强。对市售的尿素[13C]呼气试验诊断试剂盒中尿素-13C 同位素丰度测试结果为99.21%13C，市售产品符合现行2022 版的美国药典方法[16]中有关尿素-13C 同位素丰度大于等于99.0%13C 的要求。表5 结果表明，酶催化法对于基质样品尿素[13C]呼气试验诊断试剂盒同样适用，同时酶催化法模拟“胃”中的反应过程，不仅对尿素-13C 进行了检测，也检验了辅料中是否含有微量的碳酸盐，排除辅料带来的影响。

表6 不同来源的尿素-13C 同位素丰度测定Tab.6 Determination of urea-13C isotopic abundance from different sources

采用酶催化法对市售的不同来源的尿素、尿素[13C]呼气试验诊断试剂（胶囊和试剂盒）及原料药进行13C 同位素丰度，表6 数据表明不同来源的尿素-13C 同位素丰度存在差异，建立的酶催化法测试尿素-13C 同位素丰度的检测方法适用于化学试剂、呼气试验诊断试剂及原料药尿素-13C 中13C 同位素丰度的测定。

3 结 语

本文通过对脲酶催化反应时间、脲酶催化反应温度和脲酶用量等实验参数进行优化，确定最优条件下脲酶催化反应时间为3～5 min，脲酶催化反应温度为40 ℃，脲酶用量为50 mg，开发了基于酶催化反应测定尿素-13C 同位素丰度的检测方法。测试结果表明：建立的检测方法精密度和准确度良好，能够满足不同类型的尿素-13C 同位素丰度检测的需求；建立的酶催化法既可以模拟“胃”中的反应过程、又具有快速的、专一性强、无杂质气体生成等优势，适用于化学试剂、呼气试验诊断试剂及原料药等不同类型的尿素-13C 同位素丰度的质量控制，同时可以用于检验尿素[13C]呼气试验诊断试剂盒中辅料对尿素-13C 同位素丰度是否存在干扰，为药品质量监管提供技术支持。