TBI 大鼠Claudin-5 紧密连接蛋白表达变化及CBD 干预研究

康丽，曹艳，李恒希，李佳丽，凌腾晗，尹爱平，张瑞林，李坪*

1.河南护理职业学院人体解剖与组织胚胎学教研室，河南 安阳 455000； 2.昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学系，昆明 650500； 3.昆明医科大学法医学院毒物化学系，昆明 650500

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）为神经外科常见疾病，其致残率、致死率居创伤首位[1]。TBI 发生后，机械性损伤导致神经元、轴突、胶质细胞和血管等结构剪切、撕裂和组织变形，尤其是血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的连续性和通透性受损，包裹于微血管周围的星形胶质细胞（astrocyte，AST）足板肿胀和小血管内皮细胞间的紧密连接破坏。TBI 会引起AST 和紧密连接蛋白Claudin-5 受损[2]，而大麻二酚（cannabidiol，CBD）作为大麻的天然提取物，具有镇痛、抗炎和抗肿瘤等作用，且不具神经毒性，其安全性和耐受性良好[3～6]，对蛛网膜下腔出血造成的脑损伤早期有改善作用[7]。本实验观察TBI 后紧密连接蛋白Claudin-5 的表达变化和CBD 干预对脑损伤的改善作用，探究参与构成血脑屏障的AST 和Claudin-5 蛋白表达之间的关系，为临床救治TBI 患者提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用体重（280±20）g 的健康成年雄性SD 大鼠（昆明医科大学实验动物中心提供），在标准照明（12 h 光照/黑暗）和标准环境（温度20～25 ℃，湿度55%～65%）适应性喂养1 周，自由进食和饮水，术前8 h 禁食不禁水。实验符合动物学伦理，实验期间尽可能减轻动物痛苦。

1.1.2 主要试剂 CBD（云南汉素生物公司）；兔抗Claudin-5 多克隆抗体（美国Affinity 公司）；Cy3 goatanti rabbit IgG（美 国Sigma 公 司）；488-conjugated GFAP monoclonal antibody（中国Proteintech 公司）；总RNA 提取试剂盒（日本Takara 公司）；荧光定量试剂盒（日本Takara 公司）；逆转录试剂盒（日本Takara 公司）；即用型免疫组化超敏试剂盒（福州迈新生物公司）；DAB 显色液（福州迈新生物公司）；山羊血清（北京Biotopped 公司）；抗荧光衰减封片剂（大连美仑生物公司）。

1.1.3 主要实验仪器 自由落体脑损伤打击装置（深圳瑞沃德公司）；-80 ℃冰箱（美国Thermo Fisher 公司）；LED 数显圆周摇床（美国scilogex 公司）；石蜡切片机（德国Laica 公司）；光学显微镜（德国Laica 公司）；荧光倒置显微镜（德国ZEISS 公司）；荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及神经功能缺损鉴定 参照改良的Feeney 自由落体方式制备TBI 大鼠模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（2 mL/kg）进行麻醉，额顶部剃毛并俯卧位固定于脑立体定位仪上，常规消毒后矢状位切开头皮，暴露右侧颅骨，用牙科钻钻出一个直径6 mm 的窗孔（矢状缝右侧2.5 mm，冠状缝下方2 mm），将40 g 砝码从15 cm 高度自由落下打击骨窗暴露的硬脑膜，随后止血、缝合、腹腔注射生理盐水补液等处理[8]。假手术组仅做开骨窗，不进行打击，其余实验过程相同。术后动物接受监护，直到恢复自主呼吸。依据改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS），从运动、行走、感觉、平衡木、反射5 个方面对大鼠的神经损伤评分，评分越高代表神经功能损伤越严重。测试显示大鼠TBI 模型制备成功[9]。

1.2.2 分组及给药 将符合条件的108 只大鼠随机分为形态学实验（n=54）和RT-PCR 实验（n=54），各分为3 组（Sham 组、TBI+vehicle 组和TBI+CBD 组），按8 h、1d、2 d、3 d、5 d 和7 d（n=3）6 个时间点断头取脑。其中TBI+CBD 组于造模前30 min 以及造模后6 h 腹腔注射CBD 混悬液（10 mg/kg），之后每天注射1 次直至取材，Sham 组和TBI+vehicle 组注射等量2%Tween-80 生理盐水（1 mL/kg）。

1.2.3 免疫组化染色 大鼠灌注取脑并用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋。脑组织切片厚5 μm。严格按照试剂说明书采用免疫组化SP 方法，步骤如下：切片常规脱蜡、抗原热修复；用0.01 M 的PBS-0.1% triton 缓 冲 液 冲 洗3 min×3 次，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min；滴加正常非免疫性羊血清，室温孵育10 min；滴加一抗（兔抗Claudin-5 多克隆抗体，1：100）孵育，4 ℃过夜；室温复温20 min；PBS-0.1% triton 缓冲液冲洗3 min×5次；滴加生物标记的第二抗体，37 ℃孵育15 min；PBS-0.1% triton 缓冲液冲洗3 min×3 次；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温孵育15 min；PBS-0.1% triton 缓冲液冲洗3 min×3 次；DAB 试剂显色；双蒸水冲洗3 min×3 次终止DAB 显色；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。将大鼠损伤侧/开骨窗侧皮质区作为采图和分析部位，随机选取5 个高倍视野（×400）拍片，光学显微镜下观察Claudin-5 的形态学特征，用Image J 软件对每张照片的平均光密度进行分析。

1.2.4 免疫荧光双标染色 取待测组织石蜡切片，脱蜡以及抗原修复，PBS 清洗3 min×3 次；5%山羊血清封闭30 min；加兔抗Claudin-5 多克隆抗体（1：100），4 ℃冰箱过夜；室温平衡30 min，PBS 清洗5 min×3次；加Cy3 标记羊抗兔IgG（1：200），室温孵育1 h，PBS 清 洗5 min×3 次；再 加488-conjugated GFAP 多 克隆抗体（1：200），室温孵育2 h，PBS 清洗5 min×3 次；抗荧光衰减封片剂封片。于倒置显微镜（×400）下观察染色情况，随机选取组织结构及背景清晰的5 个视野拍片，Image J 图像分析系统测量每张图片中阳性表达的平均荧光强度。

1.2.5 实时荧光定量PCR 大鼠断头取脑，分离损伤侧皮质区新鲜脑组织，用Trizol 法提取总RNA，根据说明书规范操作，用紫外线分光光度计检测RNA 样品浓度及A260 和A280 比值，每组取1 μg 总RNA 进行反转录反应生成cDNA 作为模板，Claudin-5 上游引物：CTTGGAAGGGGCTGTGGAT，下游引物：GCCAGCACAGACTCATACAC；GAPDH 上 游 引 物：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，下 游 引 物 ：GACGCCAGTAGACTCCACGACA。利 用 SYBR Green 试剂盒进行实时定量PCR 扩增，反应条件为：预变性95 ℃、30 s，变性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，进行40 次循环。独立实验重复3 次。采用实时荧光定量PCR 仪器进行Claudin-5 mRNA 定量分析。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析，数据以平均值±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用Student'st检验，P＜0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测CBD 干预对TBI 不同时间Claudin-5 mRNA 表达影响

与Sham 组相比，TBI 大鼠损伤侧皮质Claudin-5 mRNA 表达减弱（8 h～5 d），其中2 d 组的表达最低，CBD 干预后1～5 d，Claudin-5 mRNA 表达明显升高，差 异 均 有 统 计 学 意 义（P＜0.05）。7 d 组Claudin-5 mRNA 表达均无统计学差异（P＞0.05），见图1。

图1 实时荧光定量PCR 检测Claudin-5 mRNA 表达*P＜0.05，与Sham 组比较 # P＜0.05，与TBI+vehicle 组比较Fig.1 Expression of claudin-5 mRNA detected by realtime PCR* P＜0.05, vs Sham group; # P＜0.05, vs TBI + vehicle group

2.2 免疫组化检测CBD 干预对TBI 不同时间Claudin-5 阳性表达影响

Sham 组阳性细胞内皮较为连续、完整，阳性表达较强，TBI 后不同时间点Claudin-5 线条发生断裂，阳性表达的平均光密度值从8h 起逐渐下降，2d 组阳性表达降至最低值，Claudin-5 线条呈点状分布，随后有所回升，但至7d 组阳性表达仍低于Sham 组。CBD 干预后，2 d，3 d，5 d 和7 d 组Claudin-5 阳性表达的形态有所恢复，呈现较为连续、完整的细胞结构，阳性显色程度显著高于TBI 组（P＜0.05）。见图2。

图2 免疫组化检测Claudin-5 蛋白表达A：免疫组化染色（Bar=25 μm）箭头示Claudin-5 阳性 B：Image J 分析Claudin-5 光密度 * P＜0.05，与Sham 组比较 # P＜0.05，与TBI+vehicle 组比较Fig.2 Protein expression of Claudin-5 detected by immunohistochemistry A: Immunohistochemical staining (Bar=25 μm), arrows indicated positive expression of Claudin-5; B: Image J software analysis of Claudin-5 optical density values * P＜0.05, vs Sham group; # P＜0.05, vs TBI + vehicle group

2.3 免疫荧光双标检测CBD 干预对TBI 不同时间Claudin-5 和胶质纤维酸性蛋白阳性表达影响

由于RT-PCR 及免疫组化结果均显示TBI 后2 d组AST 激活最明显，Claudin-5 阳性表达下降最明显，因此选择TBI 后2 d 组做免疫荧光染色，从脑微血管区及非微血管区均可看到：与Sham 组相比，TBI 后胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）阳性表达增强，即AST 处于激活状态，主要表现为胞体变大、突起增多和变粗，贴附在脑血管内皮表面的足板肿胀，且出现断裂、点状不连续分布。而Claudin-5 阳性表达显著减低。CBD 干预后，GFAP 阳性表达减弱，即AST 的激活状态减弱，而Claudin-5 的荧光表达强度有所恢复（图3）。这进一步说明：CBD 干预能够抑制TBI 损伤引起的AST 激活，提高Claudin-5 表达。

3 讨论

国内外研究证实各种类型的脑损伤可导致BBB功能障碍[1,10]，而BBB 受损通常与微血管内皮紧密连接破坏有关。紧密连接是位于BBB 脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）最顶部的蛋白分子复合体，Claudin-5 是紧密连接蛋白的主要成分。多项研究表明，Claudin-5 主要表达于微血管内皮细胞，其阳性表达在不同的脑损伤模型中呈现不同程度的下降[10～12]。本实验参照改良的Feeney 自由落体方式制备TBI 大鼠模型[8]，通过免疫组织化学染色对Claudin-5 的平均光密度进行测量，结果显示对照组Claudin-5 呈强阳性表达，并沿血管内皮连续分布，TBI 后各时间点的Claudin-5 表达显著降低，2 d 达最低，免疫荧光染色和RT-PCR 结果与免疫组织化学结果类似。此外，在脑非血管部位同样发现Claudin-5表达下调。因此推测TBI 所致的Claudin-5 表达持续降低导致BBB 的完整性破坏，且Claudin-5 可能引起BBB 以外的大脑组织结构改变。

与Claudin-5 类似，紧密贴附于BMECs 表面的AST 对于维持BBB 结构完整和功能正常至关重要。AST 和紧密连接蛋白Claudin-5 作为血脑屏障的主要结构，两者的相互关系备受关注。文献报道Claudin-5和贴附于微血管内皮细胞表面的AST 在不同的脑损伤类型中表现有时间依赖性[12～16]。前期课题组发现TBI 后AST 表现为激活状态，胞体变大、突起增多和变粗[17]。本实验分别从脑血管区和非血管区免疫荧光双标图片发现TBI 后GFAP 阳性表达增强，说明AST 被激活，同时发现Claudin-5 表达降低。由此推测TBI 导致AST 激活，进而参与调节Claudin-5 蛋白表达。基于上述实验研究，寻找一种适合的化合物，能有效干预AST 激活及增强Claudin-5 表达，进而改善TBI 损伤显得尤为重要。

CBD 是大麻提取物中含量第二丰富的无精神活性成分的物质，其作用有别于四氢大麻酚（THC）。国内外研究CBD 与脑缺血疾病较为密集，有关CBD 与创伤性脑损伤方面的文献较少。有研究发现口服CBD 可以改善TBI 所致的慢性疼痛、抑郁等神经功能障碍[18]；对于体外BMECs 和AST 共培养制备缺血性脑损伤模型研究发现：缺血再灌注前给予CBD 是最有效的，缺血再灌注后2 h 仍可观察到保护作用，提示缺血性脑损伤后CBD 影响BBB 通透性从而发挥神经保护功能[17,19]。那么CBD 干预能否改善TBI 大鼠的神经功能障碍？本课题组前期研究发现TBI 后Claudin-5 阳性表达的平均荧光强度明显减弱，而CBD 干预后Claudin-5 表达明显升高[2]，但未能揭示干预后表达时序性变化，所以本实验主要研究CBD 干预后8 h、1 d、2 d、3 d、5 d 和7 d 6 个时间点AST 的激活程度和Claudin-5 的阳性表达变化规律，结果显示TBI 后AST 的突起足板与血管内皮细胞之间有直接接触，Claudin-5 阳性表达下降，线条状发生断裂，多呈点状分布。CBD 干预后AST 激活状态下降，Claudin-5 阳性表达逐渐增强，线条状有所恢复，干预后2 d 表现最为明显。由此推断CBD 能降低TBI 引起的AST激活及增加Claudin-5 表达，从而改善BBB 结构的完整性。

综上所述，颅脑损伤后通过CBD 干预可抑制AST 激活，提高Claudin-5 表达水平，从而改善脑损伤后BBB 通透性，CBD 对改善脑损伤的神经保护作用有待临床进一步验证。