MiR-152-3p靶向调控KLF4促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

赵建国，朱晓灵，金学英，江黎明，李振军，陈遐林

绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院，浙江 绍兴 312000，1.肿瘤内科；2.肛肠外科

结肠癌（colon cancer, CC）是常见的胃肠道恶性肿瘤，是癌症相关死亡的第二大原因[1]。据统计，CC的发病率和病死率自2000 年以来总体呈下降趋势，但在50岁以下的年轻人群中却持续上升[2]。因此，CC依然是严重威胁人类身体健康的恶性肿瘤之一，需要进一步探究其分子机制，制定具有针对性的诊断和治疗策略。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一类小的内源性单链非编码RNA，可以通过调控相应mRNA靶标的表达，进而调节众多生物过程，在不同类型肿瘤的发生发展过程中往往都伴随着miRNA的表达异常[3-4]。 miR-152-3p作为一个重要的miRNA，在多种癌细胞的发展过程中起到关键作用，如肝细胞癌[5]、非小细胞腺癌[6]、前列腺癌[7]等。在肺癌中，miR-152-3p作为lncRNA KIF9-AS1的下游靶标，可抑制肺癌细胞对顺铂的敏感性[8]。在甲状腺乳头状癌中，miR-152-3p低表达可促进甲状腺乳头状癌细胞恶性进展，且miR-152-3p通过靶向TGFA发挥作用[9]。此外，有研究报道miR-152-3p在CC中的表达异常[10-11]。但有关miR-152-3p在CC中是促癌因子还是抑癌因子的结论却不完全一致。Krüppel样因子4（Krüppellike factor 4, KLF4）是一种锌指转录因子，在多种癌症中差异表达[12-13]。KLF4同样在不同癌种中发挥促癌或抑癌作用[14-15]。在CC中，KLF4对CC细胞耐药性产生影响[16]。但miR-152-3p对CC细胞表型的影响是否与KLF4有关，还需进一步探究。因此，进一步研究miR-152-3p在CC中的分子机制，明确其在CC中的作用，具有一定意义。

本研究通过调控miR-152-3p及其靶基因在CC细胞中的表达，进一步探究miR-152-3p对调控CC细胞的增殖、迁移和侵袭过程的分子机制，明确其在CC细胞中的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂 人正常结肠上皮细胞 CCD841CON（BNCC338086）、人CC细胞系HCT116（BNCC287750）、SW620（BNCC337664）、SW480（BNCC100604）均购自北京北纳生物科技有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、链霉素、青霉素、Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、结晶紫均购自美国Thermo Fisher公司，EMEM培养基、RPMI-1640培养基、DMEM培养基、L-15 培养基购自美国Gibco公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green®Premix Ex TaqTM均购自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、ECL试剂盒、MTT溶液均购自中国Solarbio公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国Beyotime公司，PVDF膜和EZ Magna RIP Kit购自美国Millipore公司，一抗兔抗KLF4（ab215036）、兔抗GAPDH（ab181602）、二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721）均购自英国Abcam公司，pmirGLO、Luciferase Assay System均购自美国Promega公司，Transwell小室购自美国Corning公司，细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自南京凯基生物有限公司，ABI 7500 Real-Time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，荧光及化学发光成像系统购自中国Clinx公司，流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。

1.2 生物信息学分析 从TCGA数据库中下载CC表达量数据集，采用“edgeR”包对数据集进行差异分析（|logFC|＞2，adj.p value＜0.01）。利用starBase 数据库预测has-miR-152-3p靶基因以及结合位点，结合相关性分析，初步确定其靶向结合关系及表达情况。

1.3 细胞培养 CCD841CON细胞在含10% FBS、 0.1 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的EMEM培养基中培养；HCT116细胞在含10% FBS、0.1 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中培养；SW620细胞在含10% FBS、0.1 mg/mL链霉素和100 U/mL 青霉素的DMEM培养基中培养；SW480 细胞在含10% FBS、0.1 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的L-15培养基中培养。培养条件均为37 ℃，5% CO2。

1.4 载体构建和细胞转染 mimic NC、miR-152-3p mimic购自美国Thermo Fisher公司，pcDNA3.1-KLF4质粒（oe-KLF4）和空pcDNA3.1质粒（oe-NC）由上海生工生物工程有限公司合成。将CC细胞接种到6孔板中（1×105个/孔）培养。待细胞汇合度至80%左右时，按制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000将mimic NC、miR-152-3p mimic、oe-NC和oe-KLF4转染至CC细胞中，并在合适的培养基中培养，培养条件：37 ℃，5% CO2。

1.5 RT-qPCR 使用TRIzol试剂从结肠癌细胞中提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser将RNA反转录为cDNA。接着使用TB Green®Premix Ex TaqTM在ABI 7500 RT-PCR系统上进行RT-qPCR检测。miR-152-3p以U6为内参，KLF4以GAPDH为内参，引物序列见表1。用2-ΔΔCt法比较相对表达量的差异。

表1 引物列表

1.6 Western blot 用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白，随后用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白进行定量。经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，再将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜于5%脱脂牛奶中封闭1 h，随后将膜分别与一抗兔抗KLF4（1:1 000）、一抗兔抗GAPDH（1:10 000）在4 ℃下孵育过夜。TBST清洗3次后，与辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1:2 000）在室温下孵育2 h。使用ECL试剂盒在荧光及化学发光成像系统检测蛋白条带并拍照。

1.7 双荧光素酶报告基因检测 将细胞接种到24孔板中，构建含有WT-KLF4（野生型）和MUT-KLF4（突变型）两种pmirGLO荧光素酶质粒。随后将mimic NC和miR-152-3p mimic与WT/MUT-KLF4 质粒共转染到细胞中。转染48 h后，根据厂商说明书使用 Luciferase Assay System测定荧光素酶活性。

1.8 RNA结合蛋白免疫沉淀实验 使用EZ Magna RIP Kit，根据制造商的说明书进行RIP实验。将SW480细胞接种到培养皿中，使用RIP裂解缓冲液裂解细胞，并加入anti-KLF4抗体或正常兔IgG免疫沉淀RNA-蛋白复合物，在4 ℃孵育6 h后，纯化共沉淀的RNA，并进行RT-qPCR分析。

1.9 MTT实验 收集对数期CC细胞，接种于96 孔板（3×103个/孔），在37 ℃、5% CO2条件下培养。在培养24、48、72、96 h时，小心吸去上清，加入 90 μL新鲜培养液，再加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h。随后吸掉上清，每孔加入100 μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在570 nm处测量各孔的吸光值。

1.10 划痕愈合实验 将转染后的CC细胞接种在6孔板中（2×105个/孔）培养，当细胞汇合度达80%左右时，用200 μL移液管尖端轻轻刮擦经过孔中心垂直于孔板路径上的细胞，PBS洗涤除去分离的细胞，加入无血清培养基，在0 h和24 h时分别在显微镜下拍照记录。

1.11 Transwell侵袭实验 将用无血清培养基重悬的CC细胞加入到用基质胶包被的Transwell小室上室中，在下室添加含10% FBS的DMEM培养基。在37 ℃和5% CO2条件下培养24 h。除去底部膜表面的细胞后，4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色，显微镜下观察，拍照。

1.12 流式细胞术检测细胞周期 收集转染48 h后的CC细胞，按照细胞周期试剂盒说明书，制备单细胞悬液，加入预冷的70%乙醇固定，4 ℃下过夜。PBS洗去固定液，1 000 r/min离心3 min，收集沉淀细胞。加入提前配制好的500 μL PI/RNase A染色工作液，室温避光30 min后，使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.13 流式细胞术检测细胞凋亡 收集转染48 h后的CC细胞，按照细胞凋亡试剂盒说明书，用胰蛋白酶（不含EDTA）消化细胞，然后收集并重悬于PBS （4 ℃）中。1 000 r/min离心细胞并去除PBS后，加入Binding Buffer轻轻吹匀制备单细胞悬液。加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）混匀后，加入5 μL PI。室温下避光10 min，随后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.14 统计学处理方法 每次实验进行3次技术性重复，采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行分析。正态分布计量资料以表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Students’t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-152-3p在CC中表达上调促进细胞恶性行为 从TCGA数据库中下载表达量数据集的数据[正常组织（n=8），肿瘤组织（n=457）]。对数据进行差异分析，相对于正常组织，miR-152-3p在肿瘤组织中显著上调（P＜0.001），见图1A。qRT-PCR检测miR-152-3p在人正常结肠上皮细胞CCD841CON和人CC细胞HCT116、SW620、SW480中的表达情况，结果表明人CC细胞中miR-152-3p的相对表达量均显著高于人正常结肠上皮细胞（P＜0.01），见图1B。选取相对表达较高的SW480细胞与mimic NC和miR-152-3p mimic进行转染。RT-qPCR检测转染后的两组SW480细胞miR-152-3p相对表达量，结果显示转染miR-152-3p mimic后的细胞miR-152-3p表达量显著增高（P＜0.01），见图1C，证明转染效率较好，可用于后续实验。MTT实验结果显示，过表达miR-152-3p的SW480细胞增殖能力显著高于正常表达的细胞（P＜0.01），见图1D。细胞划痕愈合实验结果显示，过表达miR-152-3p后细胞迁移能力较正常表达miR-152-3p的细胞显著增高（P＜0.001），见图1E。Transwell实验结果显示，过表达miR-152-3p的细胞侵袭能力显著增高（P＜0.01），见图1F。细胞周期实验结果显示，miR-152-3p过表达使G0/G1期细胞所占比例显著降低（P＜0.01），见图1G。细胞凋亡实验结果显示，过表达miR-152-3p使SW480细胞凋亡率显著降低（P＜0.01），见图1H。

图1 miR-152-3p在CC细胞中高表达且促进细胞恶性行为

2.2 miR-152-3p和KLF4 存在靶向结合关系 从TCGA数据库下载表达量数据集的数据[n（正常组织）=41，n（肿瘤组织）=480]，分析得KLF4在肿瘤组织中显著下调（P＜0.01），见图2A。相关性分析结果显示KLF4与miR-152-3p呈现显著负相关（P＜0.01），见图2B。RT-qPCR和Western blot检测KLF4的mRNA和蛋白在人正常结肠上皮细胞CCD841CON和人CC细胞HCT116、SW620、SW480中的表达情况，结果显示，人CC细胞中KLF4的mRNA和蛋白相对表达量均显著低于人正常结肠上皮细胞（均P＜0.01），见图2C。通过starBase数据库预测得miR-152-3p与KLF4存在结合位点（图2D）。为验证miR-152-3p和KLF4之间的关系，进行双荧光素酶报告基因检测和RIP实验。双荧光素酶实验结果显示过表达miR-152-3p显著降低了人CC细胞中野生型KLF4 报告基因的荧光活性 （P＜0.01），而对突变型KLF4报告基因的荧光活性没有影响（P＞0.05），见图2E，表明miR-152-3p和KLF4之间存在靶向关系。RIP实验表明，与IgG组相比，在anti-KLF4免疫沉淀中，miR-152-3p的表达量显著增加（P＜0.01），见图2F，表明miR-152-3p可能直接与KLF4相互作用。随后，RT-qPCR和Western blot实验检测转染了mimic NC和miR-152-3p mimic的SW480细胞中KLF4的表达水平。结果显示，过表达miR-152-3p使细胞中KLF4的mRNA和蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01），见图2G，表明miR-152-3p与KLF4呈负相关性，与生物信息学分析的结果一致。

图2 miR-152-3p靶向下调KLF4的表达

2.3 KLF4在CC中抑制细胞恶性行为 选取相对表达量变化较大的SW480细胞与oe-NC和oe-KLF4进行转染。RT-qPCR和Western blot检测转染后的两组细胞KLF4的mRNA和蛋白相对表达量，结果显示转染了oe-KLF4的细胞KLF4的mRNA和蛋白表达量均显著增高（P＜0.01），见图3A，转染效率较好。MTT实验结果显示，相较于较正常表达的细胞，过表达KLF4的细胞增殖能力显著降低（P＜0.01），见图3B；划痕愈合实验结果显示，过表达KLF4的细胞迁移能力显著降低（P＜0.01），见图3C；同样地，Transwell实验结果显示，过表达KLF4的细胞侵袭能力受到显著抑制（P＜0.01），见图3D。细胞周期实验结果显示，过表达KLF4使SW480细胞中G0/G1期细胞所占比例显著升高（P＜0.05），见图3E。细胞凋亡实验结果显示，过表达KLF4的细胞凋亡率显著上升（P＜0.01），见图3F。

图3 KLF4抑制CC细胞的恶性行为

2.4 miR-152-3p通过负调控KLF4 促进CC细胞增殖、迁移和侵袭 构建以下分组：mimic NC+oe-NC、miR-152-3p mimic+oe-NC、mimic NC+oe-KLF4、miR-152-3p mimic+oe-KLF4。qRT-PCR和Western blot结果显示，相较于正常表达组，单独过表达miR-152-3p的细胞KLF4的mRNA和蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.01），而单独过表达KLF4后KLF4的mRNA和蛋白的相对表达量显著增高（P＜0.01），同时过表达miR-152-3p和KLF4后，细胞中KLF4的表达情况得到恢复（图4A）。MTT实验中，单独过表达miR-152-3p的细胞增殖能力显著增高（P＜0.01），而单独过表达KLF4的细胞增殖能力显著降低（P＜0.01），两者同时过表达使增殖能力变化得到恢复（图4B）。划痕愈合和Transwell实验结果显示，单独过表达miR-152-3p后细胞的迁移能力和侵袭能力均显著增高（均P＜0.01），而单独过表达KLF4的细胞迁移能力和侵袭能力均显著降低（均P＜0.01），而同时过表达miR-152-3p和KLF4则使细胞的迁移和侵袭能力恢复到正常表达组的水平（图4C、图4D）。细胞周期和细胞凋亡实验中，单独过表达miR-152-3p的细胞处于G0/G1期的显著减少（P＜0.01），且细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）；单独过表达KLF4的细胞显著滞留于G0/G1期（P＜0.01），细胞凋亡率也显著增高 （P＜0.01）；而两者同时过表达后则抑制了这些变化（图4E、图4F）。

图4 miR-152-3p通过靶向KLF4影响CC细胞的发生发展过程

3 讨论

越来越多的研究证明，miRNA在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用。一些miRNA在多种肿瘤中表达异常，因此其可能被用于预测肿瘤患者的预后。有多个研究报道miR-152-3p在CC中表达异常[10-11，21]， 但结果却不全一致。基于此，我们通过生物信息分析初步确定miR-152-3p在CC组织中的表达上调，随后在CC细胞系中进行实验检测验证了miR-152-3p的表达，miR-152-3p过表达促进CC细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，并增加G2/M细胞比例。这表明，本研究中miR-152-3p在CC中发挥促癌作用。

目前对于miR-152-3p的研究报道显示，其可以通过作用于多个靶基因发挥肿瘤调控作用，如 SLC7A5[22]、RAB14[23]和ITGA9[24]等。本研究中，我们通过生物信息分析预测到miR-152-3p与KLF4具有结合位点，并利用双荧光素酶和RIP实验验证了两者的靶向结合关系。接着我们对miR-152-3p和KLF4进行相关性预测分析，并通过qRT-PCR和Western blot实验验证了miR-152-3p与KLF4 呈负相关性。KLF4是一个锌指转录因子，通过上调p21WAF1/Cip1和下调cyclin D1来抑制结直肠癌细胞的增殖，在结直肠癌中确认为抑制肿瘤的基因[25]。本研究中KLF4过表达可抑制CC细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，并阻滞细胞周期在G0/G1期。在miR-152-3p过 表达的同时上调KLF4的表达，则可以减弱miR-152-3p过表达对CC细胞表型的促进作用。这表明在CC中，miR-152-3p通过靶向KLF4调控细胞表型。有研究发现，KLF4与干细胞分化有关[26]。MA等[14]研究发现KLF4与整合素β4结合后，通过维持癌症干细胞形状对神经胶质瘤发挥促进作用。此外，有研究报道，KLF4对上皮向间充质转化（epithelial mesenchymal transformation, EMT）诱导转录因子发挥抑制作用，进而对EMT的发生产生影响[27]。因而，我们猜测在CC中，miR-152-3p靶向KLF4对CC细胞增殖、迁移和侵袭等产生影响，其中KLF4 可能通过影响多种途径，比如细胞干性、EMT进程等对CC细胞发挥作用。当然，这还需要在未来的研究中继续探究。

综上所述，本研究明确了miR-152-3p在CC中为促癌因子，并参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究尚存不足之处，今后还需利用动物实验进行进一步验证，并纳入临床样本进行检测，使其能真正应用于临床。