针刺调控不同信号通路改善帕金森病的研究进展*

崔华,杨文韬,程光宇,程为平,王轩

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150006; 2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一种常见于中老年人的神经系统退行性疾病,主要临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌肉强直、姿势步态障碍等运动症状,以及自主神经功能障碍、认知障碍、精神症状等非运动症状[1]。据不完全统计,我国PD患者约284万例,占全球PD患者的33.37%,且男性好发率较高。随着老龄化的加剧,PD的发病率也逐渐增高[2]。PD的发病与基因遗传、年龄、环境等因素相关,主要病理特征是中脑黑质致密区多巴胺能神经元的丧失和路易小体的形成,涉及α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的异常聚集、神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍等方面[3]。现有治疗手段,无论是药物还是手术,均无法阻止PD的发展,且长期服药不良反应明显,药效持续时间逐渐缩短。多项研究表明,针刺治疗PD具有一定优势,可有效改善PD运动及非运动症状,同时,延长西药的药效发挥,减轻药物不良反应[4-5]。针刺治疗PD的临床应用仍存在一定的局限性,部分学者对其研究存在争议。为进一步证实针刺治疗PD的有效性,本文整理了近年来相关实验研究,对针刺调控不同信号通路改善PD的作用机制进行分析,为临床开展高质量的随机对照试验研究提供一定的理论基础。

多巴胺能神经元细胞的生长、变性、凋亡受多种信号通路的影响。研究发现,在PD发病早期,针刺干预能够减少多巴胺能神经元的退行性病变,调节多巴胺能回路的平衡,延缓PD的进展,但其作用机制尚不明确[6]。具体而言,针刺能够通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threoninekinase,AKT)信号通路、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸激酶受体B (Tyrosine kinase receptorB,TrkB)信号通路、核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(anti-oxidantresponseelement,ARE)通路、Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)等信号通路改善PD症状,现综述如下。

1 PI3K/Akt信号通路

PI3K/Akt 信号通路是参与神经细胞增殖和生存的基础途径,通过配体与受体之间的相互作用激活级联信号,进而调控细胞的生长、代谢和神经元凋亡等过程。PI3K作为一类脂质激酶,被激活后的p110亚基将磷脂酰肌醇二磷酸(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)转化为磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphate,PIP3)。PIP3作为第二信使,与Akt的PH结构域结合,使其从胞质募集到胞膜,并激活磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1,PDK1),磷酸化Thr308,使得Akt部分活化,进一步激活下游靶蛋白及信号通路传导[7]。Akt能够直接磷酸化CREB、NF-κB等多种转录因子,调控 Bcl-2、Bc1-x1等相关凋亡抑制因子,同时,可抑制下游相关凋亡蛋白半胱天蛋白酶caspase-3、caspase-9的磷酸化,从而减少细胞凋亡,保护神经元存活。PI3K/Akt信号通路与PD密切相关,相关研究已证实该通路参与了PD的神经保护[8]。研究表明,激活PI3K/Akt通路可调控PD患者Bcl-2水平,当PI3K-Akt通路激活不足时,同样会下调姿势步态障碍PD患者Akt-1的表达水平[9]。

研究显示,正常人大脑中磷酸化Akt(Ser473位点)抗体在酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫阳性多巴胺的神经元中呈高水平表达,定位于整个神经元细胞体和质膜,而PD中黑质致密部含有磷酸化Akt(Ser473位点)抗体的神经元与正常人组相比显著减少,提示Akt信号对正常人大脑黑质致密部中的多巴胺能神经传递发挥着重要作用[10]。实验发现,针刺阳陵泉穴可促进MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)诱导PD小鼠的Akt活化损伤的恢复,而鼻内给药抑制PI3K/Akt信号通路后,TH免疫组化显示针刺MPTP诱导小鼠对其多巴胺能神经元保护和运动功能改善的作用也被阻断,TH阳性神经元数目减少,细胞再生被抑制[11]。另有研究发现,电针帕金森模型大鼠的风府、太冲穴可增加黑质的PI3K、Akt蛋白表达,降低中脑黑质的 caspase-3蛋白表达,且电针组治疗后,大鼠自主运动的总路程、时间、平均速度明显高于模型组[12]。李含章等[13]研究表明,电针帕金森病小鼠可激活PI3K、Akt、胰高血糖素样肽-1受体(Glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)蛋白通路,上调黑质中p-PI3K、p-Akt、GLP-1R的活性表达及TH水平,改善PD小鼠的行动能力及自主活动,行走步态也逐渐变稳定。因此,电针能够激活PI3K/Akt信号通路,抑制多巴胺能神经元细胞凋亡水平,改善PD典型的行为症状。

2 BDNF/TrkB信号通路

BDNF是脑内含量最多的神经营养因子,广泛分布于人体中枢神经系统的各个部位,如纹状体、黑质、后脑区和腹侧被盖区,包含腹侧中脑的大部分多巴胺能细胞群。BDNF的表达可促进病变局部神经突触可塑性,电针可通过调节BDNF及相关信号通路治疗脑脊髓神经疾病。针刺后,PD小鼠的突触可塑性表现为突触前膜中的突触小泡、突触面密度不同程度地增加,而突触超微结构也趋于正常[14]。BDNF及其相关蛋白在中枢及周围神经系统的神经元和小胶质细胞均有表达,可促进神经元的生长发育、成熟及神经再生,保护神经的早期应激性损伤。TrkB是BDNF的特异性受体原,在神经营养因子受体(p75NTR)存在的情况下,BDNF对初级配体TrkB具有高度亲和力,并通过免疫球蛋白常数2 (g-c2)结构域与之相互作用[15]。BDNF与TrkB结合诱导受体二聚化,并触发多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)和Src同源结构域2(src homology domain 2,SH2)等适配器蛋白的激活。随后,激活的适配器蛋白会作用于PI3K-Akt、Ras-MAPK信号通路的激活,参与保护PD多巴胺能运动和感觉神经元的存活和活性[16]。此外,TrkB可通过激活PI3K-Akt信号通路促进内皮细胞存活,刺激血管生成,保护神经元,从而帮助修复神经血管系统[17]。

BDNF/TrkB通路的激活和功能障碍与多巴胺能神经元退变相关。研究发现,PD患者黑质BDNF/TrkB表达明显降低[18]。通过电针干预MPTP诱导小鼠,可以上调BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)和环孢素A结合蛋白(Cyclophilin,CypA)表达,而BDNF、GDNF可阻断capase 3的激活[19],因此电针通过调节该通路还可抑制capase 3的激活,阻止多巴胺能神经细胞凋亡,并改善PD的病理改变[20]。Wang等[21]通过实验研究发现,注射鱼藤酮使PD大鼠的BDNF、GDNF表达明显降低,并出现震颤、僵硬、运动减少、运动缓慢等症状,经过电针治疗后,大鼠黑质BDNF、GDNF的相关mRNA表达水平显著增加,大鼠异常PD行为明显改善,与之前的研究结果一致。另有研究发现,PD伴抑郁症患者在服用西药的基础上配合电针百会、四神聪、三阴交等腧穴,比单纯西药治疗疗效更为显著,能够明显减轻PD患者的抑郁程度,患者血清BDNF水平亦显著提高,说明电针可以刺激BDNF因子表达,以增强内源性防御系统保护神经元的能力[22]。针刺舞蹈震颤控制区联合美多芭治疗PD模型小鼠能够增加脑内BDNF表达及TH阳性神经元数目,针刺组BDNF的表达较美多芭药物组高,表明针刺可通过增加内源性脑BDNF的表达,减少黑质多巴胺神经元的丢失,从而改善PD小鼠的运动障碍[23]。有学者运用蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析发现,电针可能通过逆转TrkB受体异构体(TrkB FL和TrkB T1)之间的不平衡,阻止MPTP诱导的TrkB FL的切割或下调TrkB T1的表达,恢复磷酸化Akt、磷酸化Erk1/2和BDNF的水平,进而激活BDNF-TrkB信号通路以对抗MPTP诱导的神经毒性[24]。

3 Nrf2/ARE信号通路

Nrf2是抗氧化应激和介导免疫炎症的重要因子,存在于与其负调控因子Keap1结合的胞浆中,由7个高度保守结构域(Neh1-6)组成,其中,氨基末端的Neh-2两个基序与Keap1二聚体结合形成稳定的复合物时,Keap1可促导Nrf2在细胞质中泛素化及蛋白酶体降解[25]。在应对氧化应激或亲电试剂时,Keap1的半胱氨酸残基被修饰,Nrf2被激活进入细胞核,细胞核中CNC蛋白Nrf2的Neh1结构域与小Maf蛋白形成二聚体,识别并结合ARE序列[26],Nrf2激活ARE,其活化后可调节细胞的氧化还原状态并激活细胞保护因子的转录,参与PD对氧化应激的抵抗。此外,MAPK的4条经典通路轴也可调节ARE诱导后的Nrf2转录活性,PI3K/Akt通路也可作用于Nrf2信号通路的上游,调节血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,H0-1)[27]。Nrf2/ARE通路的激活可对抗氧化应激、线粒体功能障碍以及谷胱甘肽活性降低、脂质过氧化物增多的神经毒性[28]。Nrf2在星形胶质细胞中呈高水平表达,可被多巴胺激活以维持多巴胺神经元的存活状态。研究发现,特异性敲除小鼠胶质细胞Nrf2基因,导致其对神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)的易感性增加,而通过移植过度表达Nrf2的星形胶质细胞并激活Nrf2/ARE通路,可以保护小鼠免受6-OHDA诱导的损伤[29]。

Chen等[30]观测携带人胎盘碱性磷酸酶(hPAP)基因PD小鼠,该基因由包含核心ARE序列的启动因子驱动,经MPTP处理后的hPAP小鼠纹状体中Nrf2、ARE依赖基因表达降低,抗氧化酶(NQO1、NQO2)活性也减弱,而黑质中Nrf2、ARE依赖基因表达及两种酶的活性均有所增加,可能与激活黑质中Nrf2/ARE通路从而减少氧化应激有关。现有研究证实,针刺能够通过激活和调节Nrf2/ARE相关通路有效改善PD动物模型中的氧化应激,抑制神经变性。有学者研究发现,电针治疗MPTP诱导的ARE-hPAP小鼠后,可上调中脑与纹状体的ARE驱动基因(hPAP)、Nrf2及其调节抗氧化酶的表达,降低中脑、纹状体Iba1免疫染色在活化的小胶质细胞中的强度,减弱MPTP诱导的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等促炎症因子表达,进而减轻PD氧化应激和神经炎症[31]。Deng等[32]研究亦证明,电针A53T突变小鼠可上调中脑Nrf2蛋白及纹状体中Nrf2的表达,增加了Nrf2下游抗氧化分子HO-1和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate cysteine ligase modifier subunit,GCLM)的表达,减少小胶质细胞的活化,抑制A53T小鼠纹状体和中脑TNF-α及IL-1β的异常升高。此外,程宇核等[33]通过实验表明,电针PD大鼠风府、太冲穴能够激活抗氧化信号通路,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及抗超氧阴离子氧活性,进而减轻PD大鼠神经行为症状。

4 TLR4/NF-κB信号通路

免疫炎性反应可触发并加剧多巴胺能神经元的退变,是PD发病的重要病理基础。TLR4/NF-κB信号通路在感染性和自身免疫性中枢神经系统疾病中发挥着重要的调节作用。TLR4属于跨膜蛋白家族,可识别外源性病原体及内源性损伤相关分子,而NF-κB是TLR4的下游重要转录因子,TLR4/NF-κB通路的激活可启动下游与先天免疫反应和炎症相关基因的转录表达。研究发现,MPTP诱导的小鼠模型中,TLR4在黑质小胶质细胞中高表达,在黑质中的分布比在其他脑区更密集,表明TLR4可能是小胶质细胞中促进炎症分子释放的介质,可介导PD小鼠黑质中多巴胺能神经元死亡[34]。另有学者将MPTP诱导后的小鼠随机分为TLR4缺陷小鼠组和普通模型组,结果显示,MPTP诱导后,两组小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞计数显著增加,TLR4缺陷小鼠激活星形胶质细胞和小胶质细胞的数量明显少于模型组,此外TLR4缺陷小鼠可减弱MPTP诱导的运动障碍及黑质和纹状体TH蛋白表达,并抑制MPTP诱导的α-syn异常聚集和ROS损伤、胶质激活、NF-κB和NLRP3炎症小体信号通路介导的神经炎症[35]。

研究发现,鱼藤酮诱导的PD模型大鼠黑质 NF-κB 表达明显增高,而经电针治疗4周后,NF-κB表达水平较模型组降低,电针组的黑质26S蛋白酶体表达比模型组升高,大鼠的PD异常行为及评分也有所改善,可能与电针增强泛素-蛋白酶体系统的功能并抑制下游NF-κB通路的激活有关,触发对异常折叠蛋白质的调节机制,从而起到防治PD作用[36]。另有研究表明,电针能够改善PD大鼠的行为表现,增加中脑黑质的TH表达,下调中脑黑质TLR4、NF-κB、P65蛋白表达、减少α-突触共核蛋白(α-synuclein,α-Syn)的异常聚集及TNF-α、IL-6含量,表明电针可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻PD神经炎性反应[37]。汪瑶等[38]也证实电针干预PD小鼠可下调NF-κB、IL-6的表达,增加多巴胺能神经元的活性,针刺后,PD小鼠结肠组织杯状细胞、隐窝增加,肌层增厚,运动障碍有所改善,同时,肠道炎性反应减轻。PD患者肠道菌群及肠道相关炎症因子呈正相关[39],但目前对针刺调节TLR4/NF-κB通路改善PD患者的肠道菌群相关研究较少,今后可就该靶点进一步展开研究。

5 MAPK信号通路

MAPK信号通路是将丝裂原信号从细胞外传导到细胞核内部的重要途径,对细胞增殖、分化、凋亡等起着关键作用。MAPK信号通路通过三级激酶级联反应激活后,激活的MAPKS可磷酸化不同的下游转录因子、抗凋亡和促凋亡蛋白,再经MAPK的4条经典通路轴传导至细胞核内部。MAPK信号主要包括p38 MAPK、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kainse,JNK)和ERK5这4条信号途径。ERK/MAPK、JNK/MAPK和p38 MAPK信号通路可能对PD的多巴胺能神经元退变有不同的调控作用。研究发现,在α-syn过度表达的PD小鼠中,神经纤维缠结的分布受限与脑干、小脑的JNK、ERK磷酸化水平增加有关,但p38 MAPK表达水平在大脑区域没有变化,与其无关[40]。相反,在smad3缺陷小鼠的黑质中,ERK1/2的信号减弱,但JNK或p38 MAPK的信号不减弱,并表现出多巴胺能神经元变性及α-syn聚集形式的改变,与早期PD的发病有关[41]。

早期运用电针干预PD,可有效延缓病情进展。研究表明,电针风府、太冲穴可调节PD大鼠的MAPK/ERK1/2通路,改善鱼藤酮诱导的PD大鼠黑质区TH蛋白的低表达,进而下调p-ERK1/2、TNF-α、IL-1β蛋白表达[42],这与后期研究结果[43]一致。电针能够减少PD大鼠炎症细胞因子的表达还与调节MAPK/JNK信号通路、降低其活性底物p-c-Jun在中脑黑质区的表达相关[44],提示电针可能通过抑制MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK信号通路的激活,进而抑制PD大鼠黑质小胶质细胞引起的系列炎症反应,并减少相关炎症因子的表达,增加黑质TH阳性神经元细胞计数,改善PD的症状,延缓病情发生发展。p38/MAPK的活化可促进由不同应激源诱导的促炎细胞因子的小胶质细胞的产生,实验发现,经鱼藤酮诱导的PD大鼠中脑黑质p38磷酸化(p-p38 MAPK)、环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)的表达显著升高,越来越多的大鼠出现肢体震颤、活动缓慢、僵直及步态不稳等PD典型行为,而针刺治疗可抑制PD大鼠的p38 MAPK活化,结果表现为黑质p-p38 MAPK的表达降低,COX-2阳性细胞元数量减少,PD的异常行为表现也有所改善[45]。

6 其他信号通路

黑质真核生物起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,EIF2α)-转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)-葡萄糖调节蛋白(glucose-regiilated protein,GRP)78通路可以减轻由α-syn异常聚集引发的内质网应激负担,以防持续的应激状态超过未折叠蛋白反应的承受能力,从而引起内质网的结构功能障碍,多巴胺能神经元凋亡。研究显示,电针可以通过调节EIF2α-ATF4-GRP78通路降解或清除PD大鼠未折叠或错误折叠的α-syn异常聚集,降低中脑黑质中EIF2α、ATF4、GRP78的蛋白异常高表达,抑制内质网应激状态,使下游的应激状态渐渐恢复正常,提高多巴胺神经细胞存活率[46]。也有研究表明,电针干预PD小鼠后会抑制内质网应激凋亡因子的激活,并下调相关蛋白和mRNA的表达,如ATF6、CHOP、Caspase12等,进而降低α-syn阳性表达,阻止了多巴胺能神经元的变性丢失。核酸内切酶(IRE1α)-凋亡信号调节激酶1(apopotosis signal regulation kinase 1 ASK1)-JNK途径是一条内质网应激介导细胞凋亡的通路[47]。在内质网应激状态中,IRE1α被激活后募集并结合肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor2,TRAF2),激活ASK1/JNK通路下游信号级联反应,最终活化促凋亡蛋白,诱导细胞凋亡。有学者研究表明,电针改善PD的作用机制可能与其抑制内质网应激通路IRE1α-ASK1-JNK的活性有关,电针治疗后的PD小鼠IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白表达水平降低,PD的典型行为表现也得到明显改善。此外,研究发现AMPK/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路可能与调控PD的细胞自噬及氧化应激反应有关,中药提取物枸杞多糖可通过该信号通路减少PD大鼠的异常蛋白聚集,修复并减轻了黑质及纹状体的线粒体损伤,改善PD[48]。目前,尚无针刺对PD模型中AMPK/mTOR通路的影响研究,有学者研究发现,头穴透刺可诱导PD模型小鼠线粒体自噬,清除α-syn的聚集,并在mTOR上游通路中发现p-AMPK表达升高,AMPK蛋白表达降低,线粒体功能及运动功能障碍有所改善[49]。同样,pink1-parkin信号通路也是介导线粒体自噬的重要途径,但目前对针刺调控该通路的研究较少,吴海洋等[50]研究发现,采用通督调神针刺能够提高PD小鼠PINK1、Parkin及其相关mRNA的表达量,TH阳性神经元数目增多,线粒体自噬水平提高。

7 小结与展望

综上所述,与PD有关的信号通路众多,而针刺调控不同信号通路改善PD的作用靶点及层次也不尽相同,如PI3K/Akt与BDNF/TrkB信号通路主要围绕促细胞生长、分化和代谢,抗神经元凋亡及保护多巴胺能神经元存活;Nrf2/ARE、TLR4/NF-κB与MAPK信号通路均参与了炎性反应调节,其中Nrf2/ARE信号通路侧重增强抗氧化酶的表达,保护细胞抗氧化应激;而TLR4/NF-κB通路以及MAPK的4条信号通路轴直接参与炎性反应的进程,而电针干预可抑制PD大鼠黑质区该通路相关蛋白活性的表达,减少促炎性因子的释放,阻止PD多巴胺能神经元变性及死亡;EIF2α-ATF4-GRP78、IRE1α-ASK1-JNK通路则可调节内质网应激状态,清除降解未折叠或错误折叠的α-syn异常聚集;pink1-parkin、AMPK/mTOR通路可提高线粒体的自噬水平,加快 α-syn的清除,保护多巴胺能神经元免于凋亡。

此外,也有不少研究表明中药可通过调节Wnt/β-Catenin通路治疗PD。Wnt信号通路主要由 β-Catenin激活基因转录介导,在调节细胞生长、凋亡、胚胎发育等生理过程中起重要作用。研究表明,肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-Catenin信号通路改善6-HODA诱导的PD大鼠运动症状,结果显示黑质内该通路的关键因子表达提高,并抑制了糖原合成酶激酶GSK-3βmRNA的表达水平,增加β-Catenin稳定性,保护多巴胺神经元[51]。梁建庆等[52]发现,高剂量的中药复方地黄颗粒可有效改善PD阴虚动风证,可能与调控右侧纹状体Wnt/β-Catenin信号通路有关,且该通路相关蛋白及P-LRP6、Fzd1蛋白水平升高,GSK-3β蛋白及mRNA表达水平也下降,有效维持了神经细胞微环境的稳定性,保护多巴胺能神经元。运用黄芩素激活Wnt/β-Catenin信号通路能够改善PD大鼠的异常运动行为,相关蛋白水平与之前研究结果一致,且黑质炎症因子水平降低,SOD水平提高,中脑黑质多巴胺炎症反应及氧化损伤减轻[53]。目前尚缺乏针刺调控Wnt/β-Catenin通路治疗帕金森病的机制研究。

PD发病机制繁杂,目前,针刺对PD的通路研究主要集中于单一分子或信号通路机制上,上下游蛋白受体的关系表达不确切,针刺对各通路的多靶点作用及在改善PD中占优势地位的信号通路有待明确;在相关实验研究中,应用通路阻断剂或相关基因敲除手段反向验证其调控机制的研究较为匮乏;以动物模型为主的基础实验分型单一,临床辨证分型需进一步优化中医证候。此外,需深入研究中医辨证选穴及针刺手法不一对细胞内信号通路的影响,从而深刻认识针刺调控PD的复杂通路机制及经络腧穴理论与多巴胺能神经元细胞内信号通路之间的内在联系,为临床应用针刺防治帕金森病及神经退行性疾病提供理论依据。